アルボウイルスの特殊なゲノムRNA構造の解析と媒介性の規定要因としての検証

虫媒病毒独特的基因组RNA结构分析及其作为中间性决定因素的验证

基本信息

批准号：
22K19185
负责人：
大手学
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

我々が発見したプラス鎖RNAウイルスに誘導される特殊なRNA構造について、その詳細を明らかにすることを目的とした。この構造を認識する抗体を用いた細胞染色により、デングウイルスの複製サイトに局在するRNAがこの構造を形成することがわかった。また、昆虫ウイルスの変異解析を行うために、FHVのTrans-replication systemを開発した。ウイルスゲノムと複製酵素をそれぞれプラスミドにクローニングし、培養細胞に導入したところ、複製が確認された。特に、プラスミド導入後2日に転写阻害剤を添加すると、複製がより活発になることがわかった。また、ウイルスの複製に必要な約250塩基のゲノムRNA領域を特定し、変異解析を行った。ゲノム配列の情報解析により、分子内構造を形成することが予想された配列に変異を導入したところ、影響がみられなかった。そこで、網羅的な変異解析を行ったところ、複数のウイルスRNA分子が相互作用している可能性が示された。このシステムでは任意の配列を導入することができることができる。そこで、担体結合性アプタマーを挿入することにより、細胞内よりウイルスRNAを高純度で生成する手法を開発した。これにより、ウイルスRNAを1-2万倍濃縮することができた。この手法によって精製したウイルスRNAを用いてin vitro解析を行ったところ、RdRPにより、ウイルスRNA自体の性質が変化していることが判明した。

目的是阐明我们发现的阳性链RNA病毒引起的特定RNA结构。使用抗体识别该结构的抗体染色表明，RNA定位于登革热病毒复制位点形成了这种结构。此外，我们开发了一种用于分析昆虫病毒突变的FHV的反式复制系统。将病毒基因组和复制酶克隆到质粒中，并引入培养细胞中，并确认复制。特别是，发现在引入质粒两天后添加转录抑制剂时，复制变得更加活跃。此外，确定了病毒复制所需的大约250个碱基的基因组RNA区域，并进行了突变分析。基因组序列的信息分析表明，将突变引入被预测形成分子内结构的序列，没有观察到影响。因此，全面的突变分析表明，多个病毒RNA分子可能相互作用。该系统可能能够引入任何序列。因此，已经开发了一种方法来通过插入载体结合适体从细胞内产生高纯度的病毒RNA。这使病毒RNA可以浓缩10,000次。使用该技术纯化的病毒RNA进行体外分析，发现病毒RNA本身的特性已通过RDRP改变。