Catabolite repression of amino acid metabolism

氨基酸代谢的分解代谢物抑制

基本信息

批准号：
22K19129
负责人：
和地正明
金额：
$ 3.99万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ペプチダーゼ多重欠損株（Δpeps株）を用いてジペプチドの添加によって発現量が変化する遺伝子を同定するために、RNA-Seq解析用の試料調製時期の条件検討を行った。しかしながら、ジペプチド添加M9グルコース最少培地で増殖してきた細胞にはジペプチドの取り込み担体（ジペプチドパーミアーゼ）をコードするdppオペロンに変異が導入されていることが判明した。従って、この細胞からRNAを抽出してRNA-Seq解析を行ってもジペプチドの影響を正しく評価できないと判断し、新しい実験系の検討を行った。大腸菌のグルタミン要求性変異株(ΔglnA株)をM9グルコース最少培地にて培養し、ジペプチドであるアラニルグルタミンと単体のグルタミンを添加した時の細胞の増殖と、添加したジペプチド及びアミノ酸の消費速度を測定した。グルタミン源として10 mMアラニルグルタミンと10 mMグルタミンをそれぞれ単独で加えたときは、アラニルグルタミンを添加した時の方がグルタミンを添加した時よりも短いラグ時間で増殖を開始し、その後の増殖速度も速かった。この時、アラニルグルタミンはグルタミンより早く消費された。興味深いことに、10 mMグルタミンに少量(0.5 mM)のアラニルグルタミンを添加すると、10 mMアラニルグルタミン添加時と同じように増殖した。このことから、単独で加えた場合にはアラニルグルタミンはグルタミンより早く資化されること、また少量のアラニルグルタミンはグルタミンの代謝を促進することが示唆された。そこで、この条件でジペプチドにより発現の変化する遺伝子の解析を行うこととした。

为了鉴定使用多个肽酶缺乏菌株（ΔPEPS菌株）添加二肽酶时的表达水平变化的基因，检查了用于RNA-SEQ分析的样品制备时间的条件。但是，已经发现，已在M9葡萄糖最小培养基中添加二肽生长的细胞已被引入DPP操纵子中，DPP操纵子编码了二肽摄取载体（二肽渗透酶）。因此，确定即使从这些细胞中提取RNA并进行了RNA-seq分析，也无法正确评估二肽的作用，并研究了一个新的实验系统。在M9葡萄糖最小培养基中培养大肠杆菌（菌株ΔGLNA）的谷氨酰胺菌株，并测量二肽丙氨酸和单个谷氨酰胺的细胞生长，并添加添加二肽和氨基酸的消耗率。当添加10 mM丙酰谷氨酰胺和10毫米谷氨酰胺作为谷氨酰胺来源时，与添加丙酰基谷氨酰胺的滞后时间更短的滞后时间开始生长，随后的生长速率也更快。目前，乙酰基谷氨酰胺比谷氨酰胺早食。有趣的是，将少量（0.5毫米）的甘酰谷氨酰胺添加到10毫米谷氨酰胺中，在加入10 mM丙酰基谷氨酰胺时的生长类似。这表明单独添加时比谷氨酰胺早于比谷氨酰胺早使用，并且少量的丙酰谷氨酰胺促进了谷氨酰胺代谢。因此，在这些条件下，我们决定分析其表达因二肽而变化的基因。