Challenge to elucidate the mechanism of cleft palate development from gene expression analysis linked to spatial information

从与空间信息相关的基因表达分析阐明腭裂发育机制的挑战

基本信息

批准号：
22K19624
负责人：
上岡寛
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究目的である、口蓋発生メカニズムの解明のため、口蓋突起癒合部におけるFillamin A (Flna)の発現に注目し、主に次の4項目の研究を実施した。一つ目は、マウス胎児口蓋の培養法を用いた器官培養実験であり、口蓋突起部上皮消失の重要な因子であるTGF-βとFlnaとの関係を検討した。具体的にはTGF-β阻害薬およびTGF-βの下流で活性化するRhoA阻害薬、さらに、siRNAを用いたFlnaのノックダウンを行い、器官培養中の口蓋での反応を観察した。この結果、TGF-β阻害薬およびRhoA阻害薬を添加した口蓋では、Flnaタンパクの産生が著しく低下していた。これらのことからFlnaは既報のTGF-βやRhoAシグナルの下流で働いていることが示唆された。二つ目は、上記の器官培養法で得られた上記の結果をより詳細に調べるため、ヒト表皮角化細胞であるHaCat細胞を用いてTGF-β経路下流で発現するFlnaと上皮間葉転換についてin vitro実験を行なった。この結果の解釈に関しては追加で実験を行う必要があると考えられる。三つ目は、遺伝子改変マウスの作成である。上皮細胞特異的にFlnaをノックダウンさせるため、KRT14-CreマウスとFlna floxマウスをどちらもJackson Laboratoryから購入した。凍結胚からそれぞれの遺伝子改変マウスを作出し、現在交配を続けている。現段階で交配に問題は認められず、約3か月程度で目的のマウスが得られる予定である。また、四つ目としてNanostring社のGeoMXを用いた空間的トランスクリプトーム解析を行うための準備実験を行なった。本研究の予備実験として既にVisiumを用いたトランスクリプトーム解析を行なっているが、Flnaに特化した更なる解析を予定している。

为了阐明上颚发育的机制，也就是本研究的目的，我们重点研究了腭突融合处Fillamin A (Flna)的表达，并进行了以下四个项目的研究。第一个是使用小鼠胎儿腭培养方法的器官培养实验，其中我们研究了TGF-β和Flna之间的关系，它们是腭突上皮消失的重要因素。具体来说，我们使用TGF-β抑制剂，即激活TGF-β下游的RhoA抑制剂，并使用siRNA敲低Flna，并观察器官培养过程中上颚的反应。结果，用 TGF-β 抑制剂和 RhoA 抑制剂处理的上颚中 Flna 蛋白的产生显着减少。这些结果表明 Flna 作用于先前报道的 TGF-β 和 RhoA 信号的下游。其次，为了更详细地研究使用上述器官培养方法获得的上述结果，我们使用HaCat细胞（人表皮角质形成细胞）来研究在TGF-β途径下游表达的Flna以及上皮-至-我们对此进行了体外实验。对于这一结果的解释，认为有必要进行额外的实验。第三步是培育转基因小鼠。为了特异性敲除上皮细胞中的 Flna，KRT14-Cre 小鼠和 Flna flox 小鼠均购自杰克逊实验室。转基因小鼠是用冷冻胚胎培育出来的，目前正在进行杂交育种。此阶段交配没有问题，预计三个月左右就能得到想要的小鼠。此外，作为第四步，我们使用 Nanostring 的 GeoMX 进行了空间转录组分析的准备实验。作为这项研究的初步实验，我们已经使用 Visium 进行了转录组分析，但我们正在计划专门针对 Flna 进行进一步的分析。