筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角に蓄積するヘパラン硫酸様物質の精製及び同定

肌萎缩侧索硬化症患者脊髓前角积聚的硫酸乙酰肝素样物质的纯化与鉴定

• 批准号: 09670637
• 负责人: 加藤 丈夫
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Yamagata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09670637/
• 关键词: 筋萎縮性側索硬化症; Hep SS-I; 脊髄; スフェロイド; ヘパラン硫酸; プロテオグリカン; ニューロポリペプチド・h3; 運動ニューロン疾患; HepSS-1; IDPN

HepSS-1が認識する物質はALSの病態に関与している可能性がある。したがって、本研究では、HepSS-1が認識する物質をヒト脊髄から分離・精製し同定する。非神経疾患症例の脊髄ホモジネートを超遠心し、上清(TBS 上清)と沈渣を得た。沈渣は8M尿素を含むTBSを用いてホモジナイズし、超遠心後、上清を回収した(8M尿素上清)。 HepSS-1を一次抗体とするWestern blottingを行い、 TBS上清画分に約24kDa、8M尿素上清画分に約18kDaの陽性バンドを認めた。SDA―PAGE、 Western blotting、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび二次元電気泳動法を用い精製を進め、以下の結果を得た。1.TBS上清画分中の24kDa蛋白質のN末端アミノ酸配列はPVDLSKWSGPLSLQEVDEQPQHであった。これはneuropolypeptideh3のN末端アミノ酸配列と完全に一致した。2.特大二次元電気泳動装置を自作し、8M尿素上清画分中の18kDa蛋白質を単一スポットにまで分離・精製したがN末端はプロックされていた。3.18kDa蛋白質のN末端をプロックしている基は、アセチルセリン、アセチルトレオエンではなく、また、ホルミル基でもなかった。4.18kDa蛋白質はリシルエンドペプチダーゼによる消化に対して抵抗性を示した。

HEPS-1认可的物质可能参与ALS的病理。因此，在这项研究中，HEPS-1认可的物质将被分离，纯化和从人脊髓中鉴定出来。对非神经疾病病例的脊柱匀浆进行了超级气概以获得上清液（TBS上清液）和沉积物。使用含有8M尿素的TBS将沉积物匀浆，在超速离心后，收集上清液（8M尿素上清液）。使用HEPS-1作为原代抗体进行蛋白质印迹，在TBS上清液中观察到了约24 kDa的正带，在8M尿素上清液中观察到约18 kDa。使用SDA-PAGE，Western印迹，阴离子交换柱色谱和二维电泳进行纯化，并获得以下结果。 1。TBS上清液中24KDA蛋白的N末端氨基酸序列是PVDLSKWSGPLSLQEVDEQPQH。这完全与神经肽H.的N末端氨基酸序列一致。 2。我们通过将8M尿素上清液中的18KDA蛋白分开和净化一个位置，建造了超大的二维电泳装置，但将N末端固定在一个位置。阻止3.18 kDa蛋白的N末端的组不是乙酰丝氨酸，乙酰硫烯，也不是甲基基团。 4.18 kDa蛋白对赖氨基内肽酶的消化具有抗性。