新規種苗生産技術の開発に向けたメバル類雄主要尿タンパク質の産生機序と機能の解析

分析雄性石斑鱼主要尿蛋白的产生机制和功能，用于开发新的种苗生产技术

• 批准号: 22KJ0070
• 负责人: 山口 燿
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0070/
• 关键词: 種苗生産; メバル属魚類; 生体指標; 雄成熟度; 尿タンパク質; 雄性ホルモン; リポカリン; スリーフィンガープロテイン

本研究は、メバル類種苗生産の効率化を阻む、「雄成熟度判定の不確実性」と「雌親魚の卵巣発達不全」の問題の解決を目標として、メバル類雄主要尿タンパク質(リポカリン様タンパク質:LCN-lp、スリーフィンガープロテイン様タンパク質:TFP-lp)の産生機序の解析を実施した。クロソイ血清中から、家兎抗LCN-lp抗体と免疫交差性を示すタンパク質(LLP)が見出された。同タンパク質の酵素免疫測定法を開発し、メバル類(クロソイ・エゾメバル)の雄において血清中の濃度を測定した結果、同タンパク質濃度は生殖腺体指数との有意な正の相関が認められ、LLPの雄成熟度指標としての有効性が示唆された。また、雄性ホルモンin vivo投与試験ならびにLCN-lp遺伝子上流ゲノム領域のin vitro転写活性解析(レポーターアッセイ)から、LCN-lpが雄性ホルモンによって誘導されることが明らかとなった。この雄性ホルモンによるLCN-lp産生誘導機構の存在は、LLPおよびLCN-lpが雄成熟度を反映する現象を矛盾なく説明すると考えられた。次に、クロソイ腎臓を試料としたTFP-lpのcDNAクローニングを行った。その結果、複数のTFP-lpサブタイプ配列が得られた。今後qPCRによるTFP-lp mRNA測定系を確立するためには、これらサブタイプのグループ化とプライマー設計が必要だが、その基盤となる情報が得られた。予備的な飼育試験から、雄主要尿タンパク質の機能解析を目的とした試験(行動試験等)には、クロソイよりも、エゾメバルに適性があると考えられた。一方で、エゾメバルについては、雄主要尿タンパク質の性状は、不明であった。そこで、将来的な機能試験を見据えて、交尾期野生エゾメバル雌雄腎臓の網羅的遺伝子発現解析(RNA-seq)データを解析した。その結果、エゾメバルにおける雄主要尿タンパク質の配列が得られた。

这项研究分析了雄性石鱼的主要尿液蛋白（Lipocalin样蛋白：LCN-LP，三指蛋白样蛋白样蛋白：TFP-LP）的生产机制，目的是解决“确定雄性成熟度的不确定性”的问题，“在确定雄性成熟度”和“在雌性父母的卵巢父母中的缺乏症”，以防止岩石产量的卵巢效率。在黑色SOI血清中发现了一种与兔抗LCN-LP抗体表现出免疫学横截面性的蛋白质（LLP）。开发了酶连接的免疫吸附测定法，并在雄性岩石鱼（膀胱和ezomebaru）中测量血清浓度，并发现蛋白质浓度与性腺指数具有显着的正相关，这表明其作为LLP雄性成熟的指标的有效性。此外，雄性激素的体内给药测试和LCN-LP基因上游基因组区域（报告基因测定）的体外转录活性分析，揭示了LCN-LP是由雄性激素诱导的。人们认为，雄性激素诱导LCN-LP产生的这种机制始终解释了LLP和LCN-LP反映男性成熟的现象。接下来，使用黑色韧带肾脏作为样品对TFP-LP的cDNA克隆进行克隆。结果，获得了多个TFP-LP亚型序列。为了将来使用QPCR建立TFP-LP mRNA测定系统，必须将这些亚型和底漆设计分组，但是已经获得了基础信息。初步育种测试表明，在旨在对主要男性尿液蛋白（行为测试等）功能分析的测试中，Ezomebaru比黑果更适合黑果。另一方面，雄性主要尿液蛋白在ezomebaru中的特性尚不清楚。因此，在关注未来的功能测试时，分析了配合阶段的男性和雌性肾脏的全面基因表达分析（RNA-SEQ）数据。结果，获得了Ezomebaru中雄性主要尿液蛋白的序列。

项目成果

クロソイ Sebastes schlegelii 雄尿中新規リポカリンファミリータンパク質の産生制御：組織発現性状および雄性ホルモンによる産生誘導

Sebastes schlegelii 男性尿液中新型脂质运载蛋白家族蛋白的产生调节：组织表达特征和雄激素的产生诱导

• 发表时间: 2022
• 作者: 山口 燿;川崎 琢真;東藤 孝;平松 尚志
• 通讯作者: 平松 尚志

Identification and characterization of lipocalin-type prostaglandin D2 synthase homologs in the urine of male rockfish

雄性石斑鱼尿液中脂质运载蛋白型前列腺素 D2 合酶同系物的鉴定和表征

• DOI: 10.1016/j.gene.2022.147093
• 发表时间: 2023
• 期刊: Gene
• 影响因子: 3.5
• 作者: Yamaguchi Yo;Namgung Jin;Nagata Jun;Kawasaki Takuma;Hara Akihiko;Todo Takashi;Hiramatsu Naoshi
• 通讯作者: Hiramatsu Naoshi

酵素免疫測定法を用いたメバル類血清中リポカリン様タンパク質測定系の開発: 雄成熟度指標としての利用可能性の検証

开发使用酶联免疫吸附测定测量石斑鱼血清中脂质运载蛋白样蛋白的系统：验证其作为雄性成熟度指标的适用性

• 发表时间: 2022
• 作者: 山口 燿;川崎 琢真;東藤 孝;平松 尚志
• 通讯作者: 平松 尚志