新規種苗生産技術の開発に向けたメバル類雄主要尿タンパク質の産生機序と機能の解析

分析雄性石斑鱼主要尿蛋白的产生机制和功能，用于开发新的种苗生产技术

• 批准号: 22KJ0070
• 负责人: 山口 燿
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0070/
• 关键词: 種苗生産; メバル属魚類; 生体指標; 雄成熟度; 尿タンパク質; 雄性ホルモン; リポカリン; スリーフィンガープロテイン

本研究は、メバル類種苗生産の効率化を阻む、「雄成熟度判定の不確実性」と「雌親魚の卵巣発達不全」の問題の解決を目標として、メバル類雄主要尿タンパク質(リポカリン様タンパク質:LCN-lp、スリーフィンガープロテイン様タンパク質:TFP-lp)の産生機序の解析を実施した。クロソイ血清中から、家兎抗LCN-lp抗体と免疫交差性を示すタンパク質(LLP)が見出された。同タンパク質の酵素免疫測定法を開発し、メバル類(クロソイ・エゾメバル)の雄において血清中の濃度を測定した結果、同タンパク質濃度は生殖腺体指数との有意な正の相関が認められ、LLPの雄成熟度指標としての有効性が示唆された。また、雄性ホルモンin vivo投与試験ならびにLCN-lp遺伝子上流ゲノム領域のin vitro転写活性解析(レポーターアッセイ)から、LCN-lpが雄性ホルモンによって誘導されることが明らかとなった。この雄性ホルモンによるLCN-lp産生誘導機構の存在は、LLPおよびLCN-lpが雄成熟度を反映する現象を矛盾なく説明すると考えられた。次に、クロソイ腎臓を試料としたTFP-lpのcDNAクローニングを行った。その結果、複数のTFP-lpサブタイプ配列が得られた。今後qPCRによるTFP-lp mRNA測定系を確立するためには、これらサブタイプのグループ化とプライマー設計が必要だが、その基盤となる情報が得られた。予備的な飼育試験から、雄主要尿タンパク質の機能解析を目的とした試験(行動試験等)には、クロソイよりも、エゾメバルに適性があると考えられた。一方で、エゾメバルについては、雄主要尿タンパク質の性状は、不明であった。そこで、将来的な機能試験を見据えて、交尾期野生エゾメバル雌雄腎臓の網羅的遺伝子発現解析(RNA-seq)データを解析した。その結果、エゾメバルにおける雄主要尿タンパク質の配列が得られた。

本研究旨在解决阻碍石斑鱼幼苗生产效率的“雄鱼成熟度不确定”和“母鱼卵巢发育失败”的问题。我们分析了蛋白质：LCN-的产生机制。 lp和三指蛋白样蛋白：TFP-lp。在黑海蜗牛的血清中发现了一种与家兔抗LCN-1p抗体表现出免疫交叉反应性的蛋白质(LLP)。我们开发了一种针对相同蛋白质的酶联免疫吸附测定法，并测量了雄性石斑鱼（Kurosoi 和 Ezo 石斑鱼）血清中的浓度，结果发现蛋白质浓度与性腺指数呈显着正相关。这表明 LLP 作为男性成熟度指标的有效性。另外，雄激素体内给药试验和LCN-lp基因上游基因组区域的体外转录活性分析(报告基因分析)表明LCN-lp是由雄激素诱导的。雄激素诱导LCN-lp产生的机制的存在被认为是对LLP和LCN-lp反映男性成熟度的现象的一致解释。接下来，使用黑豆肾作为样品进行TFP-1p的cDNA克隆。结果，获得了多个TFP-lp亚型序列。为了将来建立使用qPCR的TFP-lp mRNA测量系统，需要对这些亚型进行分组并设计引物，并且已经获得了构成其基础的信息。从初步的繁殖试验来看，石斑鱼比黑石鱼更适合用于雄性主要尿蛋白功能分析的测试（行为测试等）。另一方面，石斑鱼雄性主要尿蛋白的特性尚不清楚。因此，着眼于未来的功能测试，我们分析了交配季节雄性和雌性野生石斑鱼肾脏的综合基因表达分析（RNA-seq）数据。结果获得了石斑鱼雄性主要尿蛋白的序列。

项目成果

クロソイ Sebastes schlegelii 雄尿中新規リポカリンファミリータンパク質の産生制御：組織発現性状および雄性ホルモンによる産生誘導

Sebastes schlegelii 男性尿液中新型脂质运载蛋白家族蛋白的产生调节：组织表达特征和雄激素的产生诱导

• 发表时间: 2022
• 作者: 山口 燿;川崎 琢真;東藤 孝;平松 尚志
• 通讯作者: 平松 尚志

Identification and characterization of lipocalin-type prostaglandin D2 synthase homologs in the urine of male rockfish

雄性石斑鱼尿液中脂质运载蛋白型前列腺素 D2 合酶同系物的鉴定和表征

• DOI: 10.1016/j.gene.2022.147093
• 发表时间: 2023
• 期刊: Gene
• 影响因子: 3.5
• 作者: Yamaguchi Yo;Namgung Jin;Nagata Jun;Kawasaki Takuma;Hara Akihiko;Todo Takashi;Hiramatsu Naoshi
• 通讯作者: Hiramatsu Naoshi

酵素免疫測定法を用いたメバル類血清中リポカリン様タンパク質測定系の開発: 雄成熟度指標としての利用可能性の検証

开发使用酶联免疫吸附测定测量石斑鱼血清中脂质运载蛋白样蛋白的系统：验证其作为雄性成熟度指标的适用性

• 发表时间: 2022
• 作者: 山口 燿;川崎 琢真;東藤 孝;平松 尚志
• 通讯作者: 平松 尚志