オートファジーにおける膜間脂質輸送の駆動力の解明

阐明自噬过程中膜间脂质转运的驱动力

基本信息

批准号：
22KJ0044
负责人：
濱祐太郎
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0044/
关键词：
オートファジー小胞体

项目摘要

本研究は、小胞体に存在するオートファジー必須タンパク質の分子機能解析を通じて、脂質輸送の駆動力を明らかにすることを目的としている。これらは脂質二重層の外層と内層の脂質を転移させる層間輸送活性を持つと考えられているが、これでは現状のモデルに矛盾が生じる。研究開始当初は、それらの精製タンパク質を調製しリポソームに組み込んでIn vitro再構成系を構築し、それ主体として、層間輸送活性以外の機能を調べる方針であった。しかし、In vitro再構成系の構築にはもっと具体的な仮説が必要であることに気付き、生理的機能の情報を集めることが先決であると判断した。そこで培養細胞等を用いた生理的解析を優先した。オートファジー不全細胞では、オートファジー実行タンパク質の遺伝学的階層性を評価できず、ある遺伝学的バックグラウンドの細胞を用いる必要がある。しかし、当該タンパク質についてはそのような細胞が作製されていない。そこで、CRISPR-Cas9システムを用いてノックアウト細胞の樹立を目指したが、成功しなかった。当該タンパク質の欠損は大きな成長阻害を呈するが、アダプター欠損細胞には既に成長阻害が認められる。そのため、それらを同時に欠損すると、成長阻害の程度が、増殖が困難なレベルに達してしまうことが失敗の原因と考えられた。文献を調査および配列解析を行ったところ、遺伝子改変が容易なあるモデル生物が当該タンパク質のホモログを持つことを見出した。そこで、所属研究室にその生物を導入し、当該遺伝子の欠損細胞を作製した。その欠損細胞は、哺乳類細胞とは異なる表現型を示すことがわかりつつある。その生物は哺乳類のような後生動物（メタゾア）より前に系統的に分岐しており、脂質組成なども異なる。当該タンパク質の生理機能の進化を系統進化と結び付けて考えることで、分子機能にたどり着くヒントが得られるかもしれない。

这项研究旨在通过对内质网中存在的必需自噬蛋白的分子功能分析来阐明脂质转运的驱动力。这些被认为具有层间运输活性，可从脂质双层的外部和内部层转移脂质，但这在当前模型中呈现出矛盾。研究开始时，该计划是准备这些纯化的蛋白质，并将它们掺入脂质体中以构建体外重建系统，并研究以外的层间运输活性作为主要主题的功能。但是，我们意识到需要更具体的假设来构建体外重建系统，并决定收集有关生理功能的信息是首要任务。因此，使用培养细胞等的生理分析得到了优先级。在自噬缺陷细胞中，无法评估进行蛋白质自噬的遗传层次结构，并且需要使用来自某种遗传背景的细胞。但是，没有为蛋白质产生这种细胞。因此，我们旨在使用CRISPR-CAS9系统建立基因敲除细胞，但并不成功。蛋白质缺乏表现出显着的生长抑制作用，但在适应器缺陷的细胞中已经观察到生长抑制作用。因此，人们认为失败是由于这样的事实，即如果这些失败同时缺乏，生长抑制程度将达到难以增殖的水平。在研究文献的序列分析和序列分析之后，发现很容易遗传修饰的模型生物具有蛋白质的同源性。因此，将生物体引入实验室，并产生缺乏基因的细胞。显然，有缺陷的细胞表现出与哺乳动物细胞不同的表型。这些生物体会系统地分支在哺乳动物（甲基酸）等后生动物之前，并具有不同的脂质组成。通过将所讨论蛋白质的生理功能的演变与系统发育进化联系起来，我们可以提供提示以达到分子功能的提示。