微小電極と合成モレキュラー・プローブによる生物膜・グラニュール汚泥の菌叢動態解析

使用微电极和合成分子探针分析生物膜和颗粒污泥中的细菌菌群动态

基本信息

批准号：
09680545
负责人：
原田秀樹
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、集塊化増殖体内でのin situな物質代謝特性把握するために,先端径が10〜20μm程度のガラス製チップで構成される種々の微小電極(Microelectrodes)センサーを開発製作し,嫌気性微生物アグリゲート(UASB反応器で培養されたグラニュール汚泥)および好気性微生物アグリゲート(固定担体上に形成された生物膜)に適用して,アグリゲート体内の任意の現位置での目的物質濃度を検出した。種々のバルク液条件下で平衡化させたフロー・セル反応器に嫌気性グラニュールもしくは好気性生物膜を固定し,マイクロセンサーを深部方向に30〜100μmピッチで貫入させて、種々の濃度勾配を測定した。作成したセンサー種は (1)嫌気性グラニュール汚泥に対して:pHセンサー/グルコース・センサー/硫化イオンセンサー (2)好気性生物膜に対して;pHセンサー/グルコース・センサー/DOセンサー/アンモニア性窒素イオンセンサー/硝酸性窒素イオンセンサー、である。さらにアグレゲート内の微生物生態学的構造を直接的に定量評価するために、種レベル、属レベルで16S rRNAをターゲットとした合成DNAプローブを設計し、In situ hybridizationして蛍光顕微鏡で目的菌を判別し、画像解析から存在量を定量化した。FISH対象菌グループとしては、(1)嫌気性グラニュールに対しては、古細菌、水素資化性メタン生成細菌、酢酸資化性メタン生成細菌、水素生産性酢酸生成菌、硫酸還元菌等について、(2)好気性生物膜試料についてはEubacteria、硝化細菌(アンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌)を定量把握した。また、ウルトラ・ミクロトームを用いて嫌気性グラニュール及び好気性生物膜を深部方向に層別切片試料を得て、FISHを適用し、アグリゲート内の深度方向菌叢分布を計測した。

在这项研究中，在为了了解原位代谢的特性，我们开发并制造了由尖端直径约为10至20μm的玻璃芯片组成的各种微电极传感器，并用它们来检测厌氧微生物聚集体（在UASB反应器中培养）。应用于需氧微生物聚集体（在固定载体上形成的生物膜）以检测聚集体内任何当前位置的目标物质浓度。将厌氧颗粒或需氧生物膜固定在已在各种散装液体条件下平衡的流动池反应器中，并以30至100μm的间距深入穿透微传感器以产生各种浓度梯度进行测量。创建的传感器类型有（1）针对厌氧颗粒污泥：pH传感器/葡萄糖传感器/硫离子传感器（2）针对好氧生物膜的pH传感器/葡萄糖传感器/DO传感器/氨氮离子传感器/硝酸盐氮离子传感器。此外，为了直接定量评估聚集体内的微生物生态结构，我们设计了一种在种和属水平上靶向16S rRNA的合成DNA探针，进行原位杂交，并使用荧光显微镜鉴定了目标细菌。通过图像分析对丰度进行量化。 FISH 的目标菌群包括： (1) 厌氧颗粒菌、古细菌、利用氢的产甲烷菌、利用乙酸的产甲烷菌、产氢产乙酸菌、硫酸盐还原菌等。 (2) 真细菌和硝化菌（氨氧化菌、定量测定需氧生物膜样品中的亚硝酸盐氧化细菌。此外，我们使用超薄切片机获得厌氧颗粒和好氧生物膜在深度方向的分层切片样品，并应用FISH测量聚集体内深度方向的细菌菌群分布。