オーキシン流入担体AUX/LAXの機能構造解析によるオーキシン輸送機構の解明

通过生长素流入载体 AUX/LAX 的功能结构分析阐明生长素转运机制

基本信息

批准号：
22KJ0564
负责人：
萩野達也
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0564/
关键词：
構造生物学植物オーキシン膜輸送体

项目摘要

AUX/LAXシンポーターは植物において生育に重要な植物ホルモンであるオーキシンの細胞内への流入に携わる膜輸送体である。オーキシンは生体内で生合成され、極性輸送によって特定の器官ごとに成長促進や屈性などの生理作用を引き起こすだけでなく、化学合成されたものが農薬として利用されている。本研究ではAUX/LAXシンポーターのアポ状態及び輸送基質である天然のオーキシンや農薬との複合体における立体構造を決定することで、植物のオーキシン輸送における輸送体の構造変化や基質認識機構といった詳細な分子基盤の解明を目的としている。これまでの実験において高純度での精製に成功したシロイヌナズナ由来AUX1およびダイズ由来LAX9について、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析による構造決定を目指して、試料調製条件やグリッド作製条件についての検討を行った。その結果、ダイズ由来LAX9について十分な粒子像の観測できるクライオ電子顕微鏡像の取得に成功した。この撮影データを用いて単粒子解析を試みたところ、十分な量の粒子像が得られていたものの粒子の二次元平均化像の収束が確認できず、三次元密度マップへの再構成が不可能であった。解析におけるパラメータの検討を行ったが、最終的にダイズ由来LAX9の三次元密度マップを得ることはできなかった。比較的分子量の小さな膜タンパク質の構造解析において、膜タンパク質を人工的な脂質二重層に再構成するという脂質ナノディスク法を用いた研究例が近年多く報告されており、現在はシロイヌナズナ由来AUX1およびダイズ由来LAX9について脂質ナノディスクへの再構成に関する検討を行っている。

AUX/LAX的分类蛋白是参与生长素细胞内流入的膜转运蛋白，这是一种对植物生长重要的植物激素。生长素是在体内生物合成的，它不仅会通过极地运输引起每个特定器官的生长促进和向热的效应，而且化学合成的产物也被用作农药。这项研究旨在阐明详细的分子基础，例如，通过确定AUX/LAX共射体的背叛以及与天然的生长素和农药的自然生长素和农药（是传输底物）的辅助结构的背叛，植物生长素传输和底物识别机制的结构变化。研究了样品制备条件和网格制备条件，用于拟南芥衍生的AUX1和大豆衍生的Lax9，在先前的实验中，它们在高纯度上成功纯化，目的是通过使用冷冻电子显微镜通过单个粒子分析来确定结构。结果，我们成功地获得了一个冷冻电子显微镜图像，该图像允许大豆衍生的Lax9的足够粒子图像。当尝试使用这些摄影数据进行单个粒子分析时，尽管获得了足够数量的粒子图像，但未确认粒子的二维平均图像的收敛性，并且无法重建为三维密度图。尽管在分析中检查了参数，但最终无法获得大豆衍生的Lax9的三维密度图。在具有相对较小分子量的膜蛋白的结构分析中，近年来使用脂质纳米虫法报道了许多研究示例，其中将膜蛋白重组为人造脂质双层，现在我们正在考虑重建了拟南芥的Aux1和Soybean-soybean-derbean-dedlipss99999999。