一重項酸素を活用した細胞内タンパク質間相互作用ダイナミクス解析法の創成

利用单线态氧创建细胞内蛋白质相互作用动力学分析方法

基本信息

批准号：
22KJ0264
负责人：
中根啓太
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0264/
关键词：
細胞内標識タンパク質化学修飾タンパク質間相互作用

项目摘要

タンパク質間相互作用は生命現象を司り、特定の刺激に応答し、特定の空間・特定の時間で起こるものが多く存在する。本申請では、短時間かつ局所空間で選択的に進行するタンパク質標識反応を応用することで、上記のような細胞内における動的なタンパク質間相互を検出する技術を確立する。当該年度において、当初の計画に従い、細胞内における標識反応の高効率化、および細胞内の局所空間において光触媒を用いたタンパク質標識反応の制御を試みた。細胞内における標識反応を精査するため、当初予定していた光触媒のみならず、新たな光触媒を核に局在させた後、光照射を行うことで、標識反応を行った。その後、共焦点顕微鏡観察において、標識反応の進行を確認すると、複数の触媒および標識剤において、核選択的に標識反応が進行することを明らかにした。さらに、プロテオミクス解析におけるサンプル調製法についても種々検討を行い、生細胞よりタンパク質を抽出する手法、および標識されたタンパク質を精製して検出する手法を確立した。一方で、光触媒構造に着目し、応用する光触媒的タンパク質標識反応を精査した。光触媒選定の過程において、一重項酸素産生により進行するヒスチジン残基標識反応を選択的に起こす光触媒構造、および一電子移動反応により進行するチロシン残基標識反応を選択的に触媒する光触媒構造を見出した。これらはいずれも細胞イメージングに用いられる蛍光色素でもあるため、触媒分子を用いることで細胞内イメージングを行いつつ、タンパク標識反応を進行させることができると期待される。

蛋白质 - 蛋白质相互作用控制生命现象，对特定刺激做出反应，并在特定的空间或时间内发生。在此应用中，我们将建立一项技术，用于通过应用蛋白质标记反应在短时间内选择性地在局部空间中选择性进展，从而在细胞内检测动态蛋白质对蛋白质相互检测。在这个财政年度，根据原始计划，我们试图提高细胞内标记反应的效率，并使用细胞内局部空间中的光催化剂来控制蛋白质标记反应。为了检查细胞内的标记反应，不仅是最初计划的光催化剂，而且还将新的光催化剂定位于核，然后受到光照射以执行标记反应。随后，当通过共聚焦显微镜证实标记反应的进展时，据揭示了标记反应在多个催化剂和标记剂中有选择地进行核进行核。此外，还研究了各种用于蛋白质组学分析的样品制备方法，并建立了从活细胞中提取蛋白质并净化和检测标记蛋白质的蛋白质的方法。另一方面，研究了所使用的光催化蛋白标记反应。在光催化剂选择过程中，我们找到了一种光催化结构，该结构有选择地引起组氨酸残基标记反应，该反应通过单线氧的产生进行，以及一种有选择地催化酪氨酸残基标记反应的光催化结构，该反应通过单线转移反应而进行。由于所有这些都是细胞成像中使用的荧光染料，因此可以预期，通过使用催化分子，可以在进行细胞内成像时进行蛋白质标记反应。