Elucidating novel pathological mechanisms of lung fibrosis using the anti-fibrotic drug as molecular probes

以抗纤维化药物为分子探针阐明肺纤维化的新病理机制

• 批准号: 22KJ1552
• 负责人: 竹内 大修
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1552/
• 关键词: 肺線維症; 標的探索; 質量分析; ピルフェニドン; クリックケミストリー; AP-MS

本年度は、あらかじめ合成済みであったピルフェニドン類縁体プローブを用いて、ピルフェニドンの標的因子を捕捉するための実験系の確立を行った。プローブには反応性の異なる2つのアジド基が含まれており、それらをそれぞれ標的とのクロスリンク、精製のためのクリック反応に用いる。当初はヒト肺線維芽細胞の抽出液中において、紫外線の照射によるプローブと標的との結合反応を行うことを考えていたが、合成したプローブの反応性の高さと反応特異性を考慮し、生細胞内にプローブを直接添加することによる標識反応について検討した。確立した反応系によりピルフェニドンの標的因子をラベルした後、磁気ビーズを用いたクリック反応による標的分子の精製と濃縮を行い、質量分析によるピルフェニドンの標的タンパク質群の網羅的な同定解析を行った。プローブに類似した分子を用いた競合阻害の有無を指標とし、得られた標的候補の中から統計的解析によりピルフェニドンと強く相互作用することが考えられる有望な候補因子を絞り込んだ。現在、これらについてリコンビナントタンパク質の発現ベクターを作製しており、これをHEK293T細胞で強制発現させてプローブと反応させることにより、ピルフェニドンとの結合性について再検証を行っている。現在、ピルフェニドンとの相互作用が確認できた分子が得られており、培養細胞や動物モデルを用いてピルフェニドンの標的因子が線維化に与える影響について解析を行っている。

今年，我们建立了一个实验系统，使用预先合成的吡非尼酮类似物探针捕获吡非尼酮的目标因子。该探针包含两个具有不同反应性的叠氮基团，用于与靶标交联以及用于纯化的点击反应。最初，我们考虑在人肺成纤维细胞提取物中利用紫外线照射在探针和靶标之间进行结合反应，但考虑到合成探针的高反应活性和反应特异性，我们决定通过将探针直接添加到其中来研究标记反应。细胞。利用所建立的反应体系标记吡非尼酮的目标因子后，利用磁珠点击反应对目标分子进行纯化和浓缩，并利用质谱法对吡非尼酮的目标蛋白组进行全面的鉴定和分析。使用与探针类似的分子作为指标，以是否存在竞争性抑制为指标，通过对获得的目标候选物进行统计分析，缩小了被认为与吡非尼酮强烈相互作用的有希望的候选因子的范围。我们目前正在为这些蛋白质创建重组蛋白的表达载体，并通过迫使它们在 HEK293T 细胞中表达并与探针反应来重新检查它们与吡非尼酮的结合特性。目前，已获得被证实与吡非尼酮相互作用的分子，并正在利用培养细胞和动物模型分析吡非尼酮靶因子对纤维化的影响。

项目成果

肺線維症治療薬ピルフェニドンの標的分子群の同定解析

肺纤维化药物吡非尼酮靶分子的鉴定与分析

• 发表时间: 2023
• 作者: 竹内大修;山本雪乃;横島聡;辰川英樹;人見清隆
• 通讯作者: 人見清隆