オンチップ迅速核酸増幅-免疫FET検出によるPOCT多項目診断バイオセンサの開発

利用片上快速核酸扩增-免疫FET检测开发POCT多项目诊断生物传感器

基本信息

批准号：
22KJ2239
负责人：
繁森弘基
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、細菌・古細菌の獲得免疫機構として知られるCRISPR/Cas12システムが標的遺伝子に対して迅速かつ特異的に認識し、同時にssDNA切断を応用した信号変換を行うことに着目した。そして、CRISPR分子(Cas12及びssDNA)をマイクロ流路やFET等の電極センサアレイ上に修飾した迅速病原微生物同定技術の実現を目指す。本年度は研究開発の概念実証として、①Cas12及びssDNAレポーターを修飾した表面におけるコラテラル切断反応の確認、②Cas12/ssDNA修飾表面を利用したワンポット多項目dsDNA検出の検討、③アレイ集積化を指向したCRISPR試薬のスポッティング法の検討に着手した。①においては、まず基板表面に対するCas12の化学修飾方法を数種類比較し、最も高いコラテラル切断活性を示す条件で修飾方法を最適化した。この基板表面に対して、蛍光標識したssDNAレポーターも同時に修飾し、固相系コラテラル切断型dsDNAセンサを開発した。実際、本センサ上に標的dsDNAを添加したところ、コラテラル切断由来の蛍光減少が計測できた。②においては、上記のCas12/ssDNAレポーター修飾表面を2つのスポットにパターン化し、2種類の標的dsDNAの識別を試みた。サンプル中にスポットが標的とするdsDNAが含まれている場合は、スポット蛍光強度が40～60%程度減少した。一方、標的配列とは異なるdsDNAが含まれている場合において、スポット蛍光強度はdsDNA非存在条件と比較してほとんど減少しなかった。以上のことから、本センサを使用したワンポット多項目dsDNA検出が立証された。また、配列特異性は2塩基レベルであった。本年度後半より、検出項目数の増加を目的として③に取り組み、CRISPR試薬の吐出及び修飾条件を検討中である。

这项研究的重点是CRISPR/CAS12系统对靶基因的快速识别，称为细菌和古细菌的免疫机制，同时使用ssDNA裂解执行信号转换。目的是实现一种快速的致病微生物识别技术，其中CRISPR分子（CAS12和SSDNA）在电极传感器阵列（例如微流体途径和FET）上进行了修改。 This year, as a proof of concept for research and development, we began to investigate 1) the cholateral cleavage reaction on surfaces modified with Cas12 and ssDNA reporter, 2) the detection of one-pot multi-item dsDNA using Cas12/ssDNA modified surfaces, and 3) the spotting method for CRISPR reagents that aim to integrate arrays.在1中，首先比较了底物表面上CAS12的几种化学修饰方法，并在表现出最高的侧外裂解活性的条件下优化了修饰方法。还对荧光标记的ssDNA报告基因进行了修改，以开发固相的侧相裂解型DsDNA传感器。实际上，当将靶DsDNA添加到该传感器中时，测量了由侧侧裂解引起的荧光还原。在②中，将上述CAS12/SSDNA报告基因改性表面图案化为两个斑点，以尝试识别两种类型的靶DsDNA。当样品包含靶向斑点的dsDNA时，斑点荧光强度降低了约40-60％。另一方面，与不存在dsDNA的条件相比，当dsDNA与目标序列不同时，几乎不会降低斑点荧光强度。从上面可以证明，使用该传感器检测一锅多个项目DSDNA。另外，序列特异性在两个基础水平上。从今年下半年开始，我们正在研究③，目的是增加检测物品的数量，目前正在考虑CRISPR试剂的射出和修改条件。