血液幹細胞を用いたIDDMの遺伝子治療

使用造血干细胞治疗 IDDM 的基因疗法

• 批准号: 09877202
• 负责人: 赤司 俊彦
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877202/
• 关键词: IDDM; 遺伝子治療; 血液細胞; マクロファージ; フューリン; インスリン分泌; プロインスリン

【目的】造血幹細胞を用いたIDDMの遺伝子治療は門脈域にもインスリン分泌細胞を遊走させることができる画期的な治療法と考えられる。本研究では非β細胞に存在するFurinの酵素認識部位を導入したヒト・インスリン遺伝子を導入し、血液細胞におけるC鎖切断の有無と細胞外へのインスリン分泌能を検討した。【方法】インスリノーマRNAから正常な人のインスリンcDNAをクローニングした(INS)。非β細胞においてmatureなインスリンを分泌させるため、INS内のC鎖切断酵素認識部位をrecombinant-PCR法を用いてFurinの認識部位に変換した。この変異遺伝子(ヒトINS/Fur)をMFGベクターに組み込んだ。ヒトINS及びINS/Furをマウス由来NIH3T3及びヒト単球由来THP-1にリポフェクションにて導入し、培養液中のIRIとプロインスリン濃度を測定した。THP-1ではphorbolestelによりマクロファージ(Mφ)へ分化させ、発現量ついて比較検討した。【成績】1.NIH3T3:INS/Furを導入した群のIRIは、INSを導入した群に比較して著明な高値を示した。逆にプロインスリンは減少した。これは野生型ではプロインスリンのみが分泌されたのに対し、Furin認識部位を導入したことで非β細胞でもmatureなインスリンが分泌されたことを示している。2.THP-1:Mφへの分化の前、後に関わらずINS/Furを導入した群はNIH3T3と同程度のmatureなインスリン分泌を認めた。一方、遺伝子導入後分化させない群では有意に分泌量が少なかった。【結論】以上の実験から未分化な造血幹細胞に対して、Furin認識配列に置換された遺伝子の導入がex vivoで可能であれば、これを生体内でインスリン分泌能の高い細胞に終末分化させて、遺伝子治療に応用することが可能であると考えられた。

[客观]使用造血干细胞进行IDDM的基因治疗被认为是一种突破性的治疗方法，可以将分泌胰岛素的细胞迁移到门户静脉区域。在这项研究中，我们介绍了人类胰岛素基因，该基因引入了在非β细胞中存在的FURIN的酶识别位点，并检查了血细胞中C链断裂的存在或不存在，以及分泌胰岛素外细胞外的能力。方法：正常的人胰岛素cDNA是从胰岛素瘤RNA（INS）克隆的。为了分泌非β细胞中的成熟胰岛素，使用重组PCR将INS内的C链裂解酶识别位点转化为Furin识别位点。将此突变基因（人类/毛皮）纳入MFG载体。通过LiPofection将人INS和INS/FIR引入了小鼠衍生的NIH3T3和人单核细胞衍生的THP-1中，并测量了培养基中的IRI和促硫素浓度。在THP-1中，使用Phorbolestel将细胞分化为巨噬细胞（Mφ），并比较表达水平并检查。 [结果] 1。引入NIH3T3：INS/Fur的组中的IRI明显高于引入INS的组。相反，促硫素减少了。这表明在野生型中，只有促蛋白是分泌的，而在引入Furin识别位点，即使在非非β细胞中也分泌了大量的胰岛素。 2。引入INS/Fur的组，无论是在分化为Thp-1：Mφ之前还是之后，都显示出与NIH3T3相似的成熟胰岛素分泌。另一方面，基因转移后没有区分的组的分泌量显着降低。 [结论]从上述实验中，人们认为，如果可以在体内引入脂肪素识别序列以未分化的造血干细胞来引入基因，则可以将其在体内具有高胰岛素分泌能力并应用于基因治疗的细胞中终止分化为细胞。