生細胞内反応パラメーターに基づくフィードバック分子機構の定量解析

基于活细胞反应参数的反馈分子机制的定量分析

• 批准号: 12J07147
• 负责人: 定家 和佳子
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J07147/
• 关键词: 蛍光相互相関分光法; 生細胞内測定; タンパク質間相互作用; FCCS; 定量的パラメーター; 解離定数; Ras; ERK

Ras-ERK情報伝達系は根本的な細胞機能に貢献しているだけでなく、様々な腫瘍の発生に関与している。よって、Ras-ERK情報伝達経路を定量的に解析し、シミュレーションモデルを構築することで、抗がん剤の標的となる分子や反応の予測および検証を行うことができると考えられる。そこで本研究では、シミュレーションの構築に必要なパラメーターを生細胞内で実測し、得られたパラメーターをもとにシミュレーションモデルの構築および検証を行うことを目指した。前年度までに、Ras-ERK 情報伝達系のシミュレーションモデルを構築し、数値解析を行った。すると、「細胞内でShcがEGFRに複数個結合することが、Ras-ERK経路の活性化に重要である」という可能性を示唆する結果が得られた。この可能性を検証するために、以下の２項目に分けて実験を行った。まず、EGFRの野生型および変異体（Y1138、Y1172、Y1197）に対するEGFによるERKの活性の経時変化の計測を、ウェスタンブロッティングおよび生細胞イメージングによって計測した。Y1138、Y1172、Y1197はそれぞれ過去の論文でShcとの結合が知られている部位である(Jones RB et.al., Nature, 2006)。すなわち、もしShcがEGFRに複数個結合し、それがERKの活性に重要だとしたら、図５のWTから3Fにかけて段階的にERKの活性が減っていくことが予想される。しかし、いずれの方法においても、WTから3Fにかけて段階的にERKの活性が減っていることを確認することはできなかった。そこで次に、実際に生細胞内でShcがEGFRにいくつ結合しているのかをイメージングにより検証した。その結果、EGF刺激によって、エンドソーム上で1個のEGFRに対して約3個の割合でShcが結合していることが示唆された。

Ras-ERK信号系统不仅有助于基本细胞功能，还参与多种肿瘤的发生发展。因此，通过定量分析Ras-ERK信号转导通路并建立模拟模型，可以预测和验证作为抗癌药物靶点的分子和反应。因此，在本研究中，我们的目的是实际测量在活细胞中构建模拟所需的参数，并根据获得的参数构建和验证模拟模型。到前一年，我们已经构建了Ras-ERK信息传输系统的仿真模型并进行了数值分析。研究人员获得的结果表明“细胞内 Shc 与 EGFR 的多重结合对于激活 Ras-ERK 通路很重要”。为了验证这种可能性，我们进行了实验，分为以下两项。首先，通过蛋白质印迹和活细胞成像测量EGFR野生型和突变体（Y1138、Y1172、Y1197）的EGF诱导的ERK活性的时间过程变化。 Y1138、Y1172 和 Y1197 是先前论文中已知的与 Shc 结合的位点（Jones RB 等人，Nature，2006）。换句话说，如果多个 Shc 与 EGFR 结合，并且这对于 ERK 活性很重要，则预计 ERK 活性将从 WT 逐步降低到图 5 中的 3F。然而，无论采用哪种方法，都无法确认 ERK 活性从 WT 到 3F 逐步降低。接下来，我们使用成像来验证活细胞中实际有多少 Shc 与 EGFR 结合。结果表明，在 EGF 刺激后，Shc 以大约三比一的比例与 EGFR 结合在内体上。

项目成果

Live-cell measurements of dissociation constants of signaling molecule complexes by fluorescence cross-correlation spectroscopy.

通过荧光互相关光谱法对信号分子复合物的解离常数进行活细胞测量。

• 发表时间: 2013
• 作者: 定家和佳子

蛍光相互相関分光法による細胞内解離定数の測定法の開発

开发使用荧光互相关光谱测量细胞内解离常数的方法

Live-cell measurements of dissociation constants between signaling molecules of the EGFR-Ras-ERK MAP kinase cascade by FCCS

通过 FCCS 对 EGFR-Ras-ERK MAP 激酶级联信号分子之间的解离常数进行活细胞测量

• 发表时间: 2012
• 作者: 定家和佳子