機能性ノンコーディングRNAを用いた葉緑体形質転換による核遺伝子制御技術の開発

利用功能性非编码RNA开发叶绿体转化核基因控制技术

• 批准号: 12J00710
• 负责人: 田中 義行
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J00710/
• 关键词: 緑体形質転換; ウイロイド; ナス科; Solanum

葉緑体形質転換は花粉による遺伝子拡散がないという点で従来の遺伝子組み換えより優れた技術であるが、葉緑体は2重膜に包まれており、葉緑体内で発現したRNAやタンパク質は核遺伝子に影響を及ぼすことができないという問題点がある。本研究では、葉緑体形質転換による核遺伝子の発現制御技術の開発を目的として、葉緑体膜を通過するRNA分子・ウイロイドの利用を検討した。葉緑体形質転換用ベクターpPRV112A'にEggplant latent viroid(ELVd)のcDNA配列を導入し、形質転換用コンストラクトを作成した。コンストラクトをタバコ(Nicotiana tabacum)の葉にパーティクルガンを用いて導入し、ELVd導入タバコを得た。ELVd由来のsmall RNAを検出することによって、葉緑体内から細胞質へELVd分子が移行しているかを検証した。結果、ELVdの分解によるsmall RNAは検出されず、葉緑体から細胞質へのRNAの移行は認められなかった。併せて、ELVdの宿主範囲の調査を行い、ELVdの移行能や増殖能や機能性が発揮される植物種を明らかにした。これまでELVdの感染はナス(S.melongena)でしか報告されていない。ナスおよびその近縁種にin vitro転写で作成したELVd分子を接種した。接種処理から1カ月後の植物体の葉からRNAを抽出し、ノーザンプロットによりELVdの感染の有無を調査した。結果、S.melongena以外にも、S.aethibpicum,S.macrocarpon,S.torvum,S.mammosum,でELVdの感染が認められた。これらのことから、Solanum属のSubgenus Leptostemonumの植物はELVdの宿主になると考えられた。

叶绿体转化是一种优于传统基因重组的技术，因为没有基因通过花粉传播，但叶绿体被双层膜包围，叶绿体内表达的RNA和蛋白质的问题是它不能影响核基因。在这项研究中，我们研究了穿过叶绿体膜的RNA分子和类病毒的用途，目的是开发一种通过叶绿体转化控制核基因表达的技术。将茄子潜伏类病毒 (ELVd) 的 cDNA 序列引入叶绿体转化载体 pPRV112A' 以创建转化构建体。使用粒子枪将该构建体引入烟草（Nicotiana tabacum）叶子中以获得引入ELVd的烟草。通过检测ELVd衍生的小RNA，我们验证了ELVd分子是否从叶绿体易位到细胞质。结果，没有检测到由ELVd降解引起的小RNA，也没有观察到RNA从叶绿体转移到细胞质。此外，我们还调查了 ELVd 的宿主范围，并明确了具有 ELVd 迁移、增殖和功能的植物物种。迄今为止，仅在茄子（S. melongena）中报道了 ELVd 感染。茄子及其相关物种接种了体外转录产生的 ELVd 分子。接种1个月后，从植物的叶子中提取RNA，并通过Northern印迹研究ELVd感染的存在与否。结果，除了S. melongena之外，在S. aethibpicum、S. macrocarpon、S. torvum和S. mammosum中也观察到了ELVd感染。这些结果表明，茄属植物、细茎亚属植物可能是 ELVd 的宿主。

项目成果

形質転換プロトコールー植物編-(田部井豊 編.)

转化方案 - 植物版 -（由 Yutaka Tabei 编辑）

• 发表时间: 2012
• 作者: 田中義行