ヒト膵癌における転移と抗癌剤耐性獲得メカニズム：多光子励起蛍光顕微鏡による解析

人胰腺癌转移和抗癌耐药性获得的机制：使用多光子激发荧光显微镜进行分析

基本信息

批准号：
26462060
负责人：
橋本泰司
金额：
$ 3.16万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、抗癌剤耐性を示し悪性度が高い膵癌に関して、転移・再発過程における腫瘍の動態、遺伝子発現の経時的変化を多光子励起蛍光顕微鏡によるイメージング技術をもとに解析を行うものである。膵癌関連遺伝子(hTERT, SAMD4/DPC4,k-rasほか)、抗癌剤Gemcitabineに対する代謝・transporter蛋白のイメージング発現解析、ならびに腫瘍溶解性組み換えウイルスによる抗癌剤感受性増強を目的に遺伝子導入を試み、膵癌動物モデルを作成。プラスミッドDNAをトランスフェクションし、膵臓癌細胞株においてのHPCコンストラクトのプロモーター活性の増強後、遺伝子治療のためのヒト膵癌標的腫瘍溶解性組換えOncolytic poxvirus (poxvirus-GFP/PRFコンストラクト）の構築を行った。プラークアッセイによる組み換えウイルス力価の評価で、ベクターによる蛍光タンパクの発現を確認した。ヒトhTERTをプロモーターとするアデノウイルスベクターにGFPを組み合わせ腫瘍特異的に発現するベクターを作成。本ベクターを使用したin vitroでの検討で膵癌細胞に効率的に発現することを確認した。新規バイオマーカーとしてCirculating tumor cells (CTCs)、CTCs由来の遺伝子変異の測定を試みた。当科で行った膵癌に対する膵頭部切除105例に関し、血漿中の腫瘍細胞由来KRAS遺伝子変異をdroplet digital PCRを用いて検出。31%(33例)からctDNAを検出し、ctDNA陽性例は、有意に予後不良(MST 13.6 vs 27.6M）であった。膵癌動物モデルにおいて、転移プロモーター候補のGene chip解析を行い、いくつかの候補遺伝子を特定しているin vivoモデルにおいて多光子励起蛍光顕微鏡での解析により、転移形成の過程を描出できた。

在本研究中，我们将利用多光子激发荧光显微镜成像技术，分析抗癌药物耐药且恶性程度较高的胰腺癌在转移和复发过程中的肿瘤动态和基因表达的时间变化。使用动物对胰腺癌相关基因（hTERT、SAMD4/DPC4、k-ras 等）、抗癌药物吉西他滨的代谢/转运蛋白进行成像表达分析，以及使用溶瘤重组病毒进行基因转移以增强对抗癌药物的敏感性胰腺癌模型的创建。在转染质粒DNA并增强胰腺癌细胞系中HPC构建体的启动子活性后，我们构建了一种针对人类胰腺癌的溶瘤重组溶瘤痘病毒（痘病毒-GFP/PRF构建体），用于基因治疗Ta。通过空斑测定评估重组病毒滴度来证实载体表达荧光蛋白。我们通过将 GFP 与使用人 hTERT 作为启动子的腺病毒载体相结合，创建了肿瘤特异性表达载体。使用该载体的体外研究证实它在胰腺癌细胞中有效表达。我们尝试测量循环肿瘤细胞 (CTC) 和 CTC 衍生的基因突变作为新的生物标志物。我们在我科进行的 105 例胰腺癌胰头切除术中，使用液滴数字 PCR 检测血浆中肿瘤细胞来源的 KRAS 基因突变。 31%（33例）检测到ctDNA，ctDNA阳性病例的预后明显较差（MST 13.6 vs 27.6M）。在胰腺癌动物模型中，我们对候选转移启动子进行了基因芯片分析，并鉴定了几个候选基因。在体内模型中，我们能够通过使用多光子激发荧光显微镜进行分析来可视化转移形成的过程。