Dronpaを用いたライブイメージングによる細胞内G－アクチン濃度の時空間的測定

使用 Dronpa 通过实时成像对细胞内 G 肌动蛋白浓度进行时空测量

基本信息

批准号：
11J07828
负责人：
永井友朗
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J07828/
关键词：
ライブイメージング Dronpa ラメリポディア細胞運動コフィリン

项目摘要

本年度は、細胞内におけるG-アクチン濃度の空間分布を評価するための測定系として多点FDAP測定を行い、ラメリポディア形成時における細胞内G-アクチン濃度の空間分布を測定した。以下に成果内容を示す。ラメリポディア形成細胞における細胞内G-アクチン濃度分布の測定ラメリポディアは、先導端におけるアクチン重合を駆動力として細胞膜が押し出される事によって形成される突起構造である。ラメリポディアのF-アクチンは、先導端において盛んに重合し、後方で速やかに脱重合されG-アクチンが生成される。このようなアクチン重合・脱重合の空間的な差異によって、細胞内G-アクチン濃度分布にも勾配が生じている事が予想される。しかし、これまでにラメリポディアを伸ばしている細胞で細胞内G-アクチン濃度の空間分布を実測した報告は無く、空間的なアクチン重合・脱重合制御と細胞内G-アクチン濃度の相関関係は不明であった。そこで、ラメリポディアを伸ばしている細胞においてFDAP測定を多点的に行い、細胞内G-アクチン濃度の空間分布の評価を試みた。測定には活性型Racの強制発現により安定的にラメリポディアを形成するマウス神経芽細胞腫由来N1E-115細胞を用いた。Dronpa-アクチン、活性型Rac及びmCherryを共発現させたN1E-115細胞のラメリポディアに2点、細胞体に3点の関心領域を設定し、FDAP測定及びDronpa・アクチンとmCherryの蛍光強度の測定を行った。Dronpa-アクチン、mCherryの蛍光強度から各関心領域におけるGIF-アクチン総量及び体積を見積もり、FDAP測定によりG/F-アクチン比を求めた。さらに、これらの測定値から各関心領域のG-アクチン濃度を算出した結果、ラメリポディアの前後やラメリポディアと細胞体のG-アクチン濃度の分布との間に有意な差は見られなかった。この事から、ラメリポディアの局所的なアクチン重合・脱重合が細胞内G-アクチン濃度の空間分布に与える影響は極めて小さい事が明らかとなり、アクチン重合に対する細胞全体のG-アクチン濃度の重要性が示唆された。

今年，我们进行了多点 FDAP 测量作为评估细胞内 G-actin 浓度空间分布的测量系统，并测量了片状伪足形成过程中细胞内 G-actin 浓度的空间分布。结果如下所示。板状伪足形成细胞中细胞内G-肌动蛋白浓度分布的测量板状伪足是利用前端的肌动蛋白聚合作为驱动力，通过挤压细胞膜而形成的突出结构。板状伪足的F-肌动蛋白在前端活跃聚合，并在后端快速解聚，产生G-肌动蛋白。肌动蛋白聚合和解聚的这种空间差异预计会导致细胞内 G 肌动蛋白浓度分布的梯度。然而，迄今为止，还没有关于延伸板状伪足的细胞中细胞内G-肌动蛋白浓度的空间分布的实际测量的报道，并且肌动蛋白聚合/解聚的空间控制与细胞内G-肌动蛋白浓度之间的相关性尚不清楚。是。因此，我们尝试通过在具有扩展板状伪足的细胞中进行多点FDAP测量来评估细胞内G-肌动蛋白浓度的空间分布。为了进行测量，使用了小鼠神经母细胞瘤衍生的 N1E-115 细胞，该细胞通过强制表达活性 Rac 稳定地形成板状伪足。在共表达Dronpa-actin、活性Rac和mCherry的N1E-115细胞的片状伪足中设置两个感兴趣区域，在细胞体中设置三个区域，进行FDAP测量以及Dronpa-actin和mCherry的荧光强度测量。去了。根据 Dronpa-actin 和 mCherry 的荧光强度估算每个感兴趣区域中 GIF-actin 的总量和体积，并通过 FDAP 测量确定 G/F-actin 比率。此外，根据这些测量值计算各感兴趣区域中的G-肌动蛋白浓度，结果发现板状伪足之前和之后、或者板状伪足和细胞体之间的G-肌动蛋白浓度分布没有显着差异。这揭示了板状伪足中的局部肌动蛋白聚合/解聚对细胞内G-肌动蛋白浓度的空间分布的影响极小，表明整个细胞中G-肌动蛋白浓度对于肌动蛋白聚合的重要性。