人工マイクロRNAライブラリーを用いた植物ウイルスの複製複合体の解明

使用人工 microRNA 文库阐明植物病毒复制复合物

• 批准号: 11J02351
• 负责人: 岡野 夕香里
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02351/
• 关键词: plantago asiatica mosaic virus; ダイコンモザイクウイルス; リンゴステムルービングウイルス

本年度も引き続き、植物ウイルスの複製に関与する宿主因子およびウイルス複製を阻害する因子を網羅的に特定するためのハイスループットな系の確立に先立ち、感染効率の高い植物ウイルスベクターの構築および最適化を行った。現在、植物ウイルスベクターとしてはpotato virus X (PVX)を利用したものが広く用いられている。しかし、PVXベクターは挿入配列の安定性に問題があり、さらにシロイヌナズナには感染できず、本研究に適さない。そこで、PVXに近縁でシロイヌナズナに感染するplantago asiatica mosaic virus (P1AMV)を利用し、ウイルスベクターを開発することとした。ウイルス複製の指標とするために、GFP遺伝子をP1AMVゲノムへと挿入した。まずはPVXベクターと同様の構築法を試したが、植物への接種の結果、ベクターからGFP遺伝子の脱落が確認された。そこで、口蹄疫ウイルスが持つ自己切断配列である2A配列を挟んで、GFPと外被タンパク質を融合タンパク質として翻訳させるなどの改変を施した。その結果、植物で安定的に目的タンパク質を発現させることができた。続いて、P1AWベクターを用いてシロイヌナズナへの接種を行ったところ、ウイルスのGFP蛍光の全身拡大が確認された。次に、このベクターをシロイヌナズナのプロトプラストへと接種したところ、ウイルスのGFP蛍光が観察できた。構築したGFP挿入P1AMV「ベクターを用いることで、植物ウイルスの複製に関与する宿主因子およびウイルス複製を阻害する因子を網羅的に特定するためのハイスループットな系を確立することが可能となった。従って、本研究の成果は、植物ウイルスの複製機構の全容解明につながる有用な知見となったと考えられる。

今年，我们将继续构建和优化高感染效率的植物病毒载体，建立高通量系统，全面鉴定参与植物病毒复制的宿主因子和抑制病毒复制的因子。目前，马铃薯X病毒(PVX)被广泛用作植物病毒载体。然而PVX载体存在插入序列稳定性问题，无法感染拟南芥，因此不适合本研究。因此，我们决定利用车前草花叶病毒（P1AMV）开发病毒载体，该病毒与PVX密切相关并感染拟南芥。将 GFP 基因插入 P1AMV 基因组中，作为病毒复制的指标。首先，我们尝试了与PVX载体相同的构建方法，但接种植物的结果证实，GFP基因从载体中脱落。因此，我们进行了修饰，例如将GFP和外壳蛋白翻译为融合蛋白，夹入2A序列，这是口蹄疫病毒的自裂解序列。结果，我们能够在植物中稳定表达目标蛋白。随后，当使用 P1AW 载体接种拟南芥时，证实了病毒 GFP 荧光的全身传播。接下来，当将该载体接种到拟南芥原生质体中时，观察到病毒的GFP荧光。通过使用构建的插入GFP的P1AMV载体，可以建立高通量系统来全面鉴定参与植物病毒复制的宿主因子和抑制病毒复制的因子，因此，本研究的结果被认为提供了有用的结果。这些知识将有助于彻底阐明植物病毒的复制机制。

项目成果

First report of 'Candidatus Phytoplasma asteris" infecting hydrangea showing phyllody in Japan.

日本首次报道‘Candidatus phytoplasma asteris’感染绣球花并呈现叶状。

• DOI: 10.1007/s10327-013-0445-7
• 发表时间: 2013
• 作者: 滝波 祐輔

Carlavirus属ウイルスにおけるRNAサイレンシングサプレッサーの新規同定

卡拉病毒RNA沉默抑制子的新鉴定

• 发表时间: 2012
• 作者: 石川一也

Development of On-site Detection Kits for Fig Mosaic Virus and Phytoplasmas Based on Loop-Mediated Isothermal Amplification.

基于环介导等温扩增的无花果花叶病毒和植原体现场检测试剂盒的开发。

• 发表时间: 2012
• 作者: 岡野 夕香里

Functional analysis of RNA silencing suppressors encoded by plant viruses in the family Flexiviridae.

Flexiviridae 植物病毒编码的 RNA 沉默抑制子的功能分析。

• 发表时间: 2012
• 作者: 岡野 夕香里

Construction of an infectious cDNA clone of radish mosaic virus, a crucifer-infecting comovirus.

萝卜花叶病毒（一种感染十字花科植物的豇豆病毒）的感染性 cDNA 克隆的构建。

• DOI: 10.1007/s00705-013-1635-5
• 发表时间: 2013
• 影响因子: 2.7
• 作者: 小松 健