歯肉退縮の新規治療を目指した創傷治癒性マクロファージの解析

伤口愈合巨噬细胞分析用于治疗牙龈退缩的新方法

• 批准号: 22K10237
• 负责人: 丸岡 亮
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K10237/
• 关键词: 歯肉退縮; マクロファージ

まず、比較的作製が容易なマウス皮膚創傷モデルを作製した。全身麻酔下に、C57BL6/Jマウス（雄：6-8週齢）の背部を除毛し、生研パンチ（径6mm）を用いて背部両側に皮膚全層欠損を作製した。次に、創の収縮を防止するために、約8mm径のOリングを創部周囲に縫着した。その後、防水保護シールを貼って創部の乾燥を防止した。このようにして作製したマウスモデルにおいて、創の治癒を経時的に肉眼観察した。その後、マウスを安楽死させた後、創があった部分を含む皮膚を切除して回収し、ホルマリン固定、パラフィン包埋を行い、薄切して組織切片を作製した。切片をヘマトキシリン＆エオジンで染色し、創部の両端の距離や、肉芽組織形成の程度、マクロファージを含む炎症細胞浸潤の程度などを評価した。また、投与するマクロファージの調製については、骨髄細胞由来および脾臓細胞由来のものについて比較検討した。また、ヒアルロン酸濃度依存的にM2d様の性質を持つようになることを、リアルタイムPCRでVEGFの発現が上昇し、TNFαの発現が低下すること、貪食能アッセイでの貪食能亢進や、トランスウェルアッセイで血管内皮細胞の遊走能が亢進することなどで再確認した。これを踏まえて、骨髄細胞をM-CSF存在下で１週間培養し、得られた骨髄由来マクロファージを、ヒアルロン酸6.7mg/mLを含む培地を用いてさらに1週間培養したものを、上記モデルの創1か所あたり2.5-5.0×10^5細胞投与した群も設定し、検討を開始した。

首先，我们创建了一个小鼠皮肤伤口模型，该模型相对容易创建。在全身麻醉下，将C57BL6/J小鼠（雄性：6-8周龄）的背部毛发去除，并使用Seiken冲头（直径6毫米）在背部两侧产生全层皮肤缺损。接下来，将直径约8毫米的O形圈缝在伤口周围，以防止伤口收缩。之后，贴上防水保护贴纸以防止伤口干燥。在如此制备的小鼠模型中，随着时间的推移目视观察伤口愈合。此后，将小鼠安乐死，切除并收集包括伤口区域的皮肤，用福尔马林固定，石蜡包埋，切片以制备组织切片。切片用苏木精和伊红染色，评价创面两端距离、肉芽组织形成程度、巨噬细胞等炎性细胞浸润程度。另外，对于施用的巨噬细胞的制备，对源自骨髓细胞的巨噬细胞和源自脾细胞的巨噬细胞进行了比较。此外，通过实时 PCR 中 VEGF 表达增加和 TNFα 表达减少、吞噬试验中吞噬作用增加以及转孔实验证实了 M2d 样特性以透明质酸浓度依赖性方式发展。表明血管内皮细胞的迁移能力增强。基于此，我们还建立了在M-CSF存在下将骨髓细胞培养1周，并且使用含有6.7mg/mL透明质酸的培养基将获得的骨髓来源巨噬细胞进一步培养1周。一组每个伤口注射 2.5-5.0 x 10^5 细胞并开始研究。