Development of therapeutic agent for Graft-versus-host-disease using conditioned media collected prepared by culturing dental pulp stem cells on frozen organ disease section

使用在冷冻器官疾病切片上培养牙髓干细胞制备的条件培养基开发移植物抗宿主病治疗剂

• 批准号: 22K10182
• 负责人: 舘原 誠晃
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tsurumi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K10182/
• 关键词: 再生医療; 難治性炎症疾患; 歯髄幹細胞; 口腔粘膜疾患

本研究の目的は、慢性移植片対宿主病:Graft-versus-host-disease (GVHD)などの免疫過剰反応疾患に対して歯髄幹細胞が有する再生環境整備機能の有用性を検討することである。本年度では、まず歯髄幹細胞を購入し、その特性についてフローサイトメトリーにて歯髄細胞の細胞膜抗原および分化能を評価した。この結果、これらの細胞は間葉系幹細胞のマーカーの発現を認め、さらには骨、軟骨、脂肪への分化能を有していた。これらの結果から購入した歯髄幹細胞が間葉系幹細胞であることを確認した。次にGVHD疾患モデルマウスの凍結肝臓切片を作製し、この切片上で歯髄幹細胞の培養を行ったが、切片上への細胞の接着が不均一となり、培養条件が一致しなかったため、再現性のある結果を得ることができなかった。そこで慢性GVHDの組織内では免疫関連因子であるIFN-γを発現した陽性細胞が存在するとの報告から、INF-γ存在下に歯髄幹細胞を刺激することにより、歯髄幹細胞が有する再生環境整備機能や免疫寛容機構に関連した液性因子が産生されるとの仮説を立てた。IFN-γによる刺激時期と投与濃度は、過去の研究報告を参考に設定した。実際には歯髄幹細胞を80%コンフルエントまで培養し、この時点でIFN-γを200 ng/mlを培養液に加えて24時間培養後、新鮮培養液に交換し、さらに24時間培養後に培養上清を回収した。現在、回収した培養上清を抗体マイクロアレイ解析にて免疫関連因子の産生量を測定している。

这项研究的目的是研究牙髓干细胞对免疫高反应性疾病（例如慢性移植物抗抗疾病）（GVHD）所具有的再生环境发展功能的有用性。在今年，我们首次购买了牙髓干细胞，并通过流式细胞仪评估其性能，以评估牙髓细胞的细胞膜抗原和分化潜力。结果，这些细胞显示了间充质干细胞的表达，并能够分化为骨骼，软骨和脂肪。这些结果证实了购买的纸浆干细胞是间充质干细胞。接下来，准备了GVHD疾病模型小鼠的冷冻肝脏切片，并在这些切片上培养牙髓干细胞，但是细胞在切片上的粘附变得异质性，培养条件不一致，因此无法获得可重复的结果。因此，我们报道说，表达与免疫相关因子IFN-γ的阳性细胞存在于慢性GVHD的组织中，并假设在INF-γ存在的情况下刺激浆状干细胞会产生与发育中的再生环境功能和牙髓干细胞所具有的免疫耐受机制相关的体液因子。根据先前的研究报告确定了IFN-γ的刺激时间和给药浓度。在实践中，将牙髓干细胞培养至80％汇合，此时将200 ng/ml的IFN-γ添加到培养基中并培养24小时，然后用新鲜的培养基代替，然后再收集24小时，收集了培养的上清液。当前，通过抗体微阵列分析测量了从收集的培养上清液中产生的免疫相关因子的量。