Development of therapeutic agent for Graft-versus-host-disease using conditioned media collected prepared by culturing dental pulp stem cells on frozen organ disease section

使用在冷冻器官疾病切片上培养牙髓干细胞制备的条件培养基开发移植物抗宿主病治疗剂

基本信息

批准号：
22K10182
负责人：
舘原誠晃
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tsurumi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K10182/
关键词：
再生医療難治性炎症疾患歯髄幹細胞口腔粘膜疾患

项目摘要

本研究の目的は、慢性移植片対宿主病:Graft-versus-host-disease (GVHD)などの免疫過剰反応疾患に対して歯髄幹細胞が有する再生環境整備機能の有用性を検討することである。本年度では、まず歯髄幹細胞を購入し、その特性についてフローサイトメトリーにて歯髄細胞の細胞膜抗原および分化能を評価した。この結果、これらの細胞は間葉系幹細胞のマーカーの発現を認め、さらには骨、軟骨、脂肪への分化能を有していた。これらの結果から購入した歯髄幹細胞が間葉系幹細胞であることを確認した。次にGVHD疾患モデルマウスの凍結肝臓切片を作製し、この切片上で歯髄幹細胞の培養を行ったが、切片上への細胞の接着が不均一となり、培養条件が一致しなかったため、再現性のある結果を得ることができなかった。そこで慢性GVHDの組織内では免疫関連因子であるIFN-γを発現した陽性細胞が存在するとの報告から、INF-γ存在下に歯髄幹細胞を刺激することにより、歯髄幹細胞が有する再生環境整備機能や免疫寛容機構に関連した液性因子が産生されるとの仮説を立てた。IFN-γによる刺激時期と投与濃度は、過去の研究報告を参考に設定した。実際には歯髄幹細胞を80%コンフルエントまで培養し、この時点でIFN-γを200 ng/mlを培養液に加えて24時間培養後、新鮮培養液に交換し、さらに24時間培養後に培養上清を回収した。現在、回収した培養上清を抗体マイクロアレイ解析にて免疫関連因子の産生量を測定している。

本研究的目的是探讨牙髓干细胞的再生环境维持功能对于慢性移植物抗宿主病（GVHD）等免疫过度反应疾病的有用性。今年，我们首先购买了牙髓干细胞，并使用流式细胞术评估了其细胞膜抗原和分化潜力。结果发现，这些细胞表达间充质干细胞标记物，并且具有分化为骨、软骨和脂肪的能力。由这些结果确认，购买的牙髓干细胞是间充质干细胞。接下来，我们制备了GVHD疾病模型小鼠的冷冻肝脏切片，并在这些切片上培养牙髓干细胞，但细胞与切片的粘附不均匀且培养条件不匹配，导致重复性较差。得到一定的结果。因此，有报道慢性GVHD组织中存在表达免疫相关因子IFN-γ的阳性细胞，通过在INF-γ存在下刺激牙髓干细胞，可以改善再生环境维持功能我们假设产生与免疫耐受机制相关的体液因子。 IFN-γ的刺激时间和给药浓度是参考以往的研究报告设定的。实际上，牙髓干细胞培养至80%汇合，此时在培养基中加入200ng/ml的IFN-γ，培养24小时，然后更换新鲜培养基，再培养24小时培养物中，除去培养物上清液。目前，我们正在通过对收集的培养上清液进行抗体微阵列分析来测量免疫相关因子的产生量。