インクレチンホルモンによるGLUT4小胞輸送促進作用における分子生物学的解析

肠促胰岛素激素促进GLUT4囊泡运输的分子生物学分析

基本信息

批准号：
22K10149
负责人：
長野公喜
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K10149/
关键词：
インクレチン GLUT4 インスリン

项目摘要

われわれは、脂肪細胞や筋細胞において、開口分泌調節タンパク質 tomosyn がインスリン依存性の糖取り込みを調節することを遺伝子組み換え技術を用いながら示してきた。一方、これらの細胞への糖取り込みはインクレチンホルモンの一つである GIP によって直接促進されることが近年明らかにされてきたが、詳細な分子機序については不明のままである。本研究では GIP による糖取り込み促進作用における tomosyn の関与を明らかにし、その分子メカニズムを解明する。これにより、糖尿病治療の新たな創薬ターゲットと成り得る候補分子の発見につながり、今後の糖尿病研究に影響を与えると考えられる。2022年度は GIP による tomosyn S760 のリン酸化の影響を調べた。脂肪細胞や筋管細胞内で GIP 刺激に対する tomosyn のリン酸化の有無を確認した。次に脂肪細胞に分化させた 3T3-L1 細胞あるいは筋管細胞に分化させた C2C12 細胞に FLAG タグを付加した tomosyn 野生体、S760をアラニンに置換しリン酸化できないように組み換えた変異体 (S760A) をそれぞれ遺伝子導入し、32Pラベルされた ATP を取り込ませ、GIP 刺激した後に抗 FLAG 抗体によって tomosyn を免疫沈降し、その放射活性をオートラジオクラフィーで比較、定量した。遺伝子導入方法は、これまでに実験実績のある、リポフェクションによって遺伝子を一過性に強制発現させる手法を用いた。

利用基因重组技术，我们发现胞吐调节蛋白 tomosyn 可调节脂肪细胞和肌肉细胞中胰岛素依赖性葡萄糖的摄取。另一方面，最近发现这些细胞的糖摄取是由肠促胰岛素激素GIP直接促进的，但详细的分子机制仍不清楚。在本研究中，我们将阐明tomosyn参与GIP的葡萄糖摄取促进作用并阐明其分子机制。这将导致候选分子的发现，这些候选分子可以作为糖尿病治疗的新药发现靶点，并有望对未来的糖尿病研究产生影响。 2022 年，我们研究了 GIP 介导的 Tomosyn S760 磷酸化的影响。我们证实了脂肪细胞和肌管中是否存在响应 GIP 刺激的 Tomosyn 磷酸化。接下来，在分化为脂肪细胞的3T3-L1细胞或分化为肌管细胞的C2C12细胞中添加了FLAG标签的tomosyn野生型，以及其中S760被丙氨酸取代并重组使其不能被磷酸化的突变体（S760A）。用32P标记的ATP转染每个基因并用GIP刺激它，用抗FLAG抗体刺激tomosyn。进行免疫沉淀，并通过放射自显影对其放射性进行比较和定量。对于基因导入方法，我们使用在实验中具有良好记录的脂转染来强制瞬时基因表达。