尿失禁に対する新規再生医療の開発へ向けた外尿道括約筋幹細胞セクレトームの機能解析

尿道外括约肌干细胞分泌组的功能分析，以开发治疗尿失禁的新型再生医学

基本信息

批准号：
22K09451
负责人：
秦聡孝
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

外尿道括約筋は膜様部尿道を取り囲む横紋筋で、尿禁制に寄与している。しかし加齢に伴い外尿道括約筋細胞は減少しており、筋細胞は脂肪細胞や線維組織に置換されて括約筋機能が低下し、これが高齢者の尿失禁の一因と考えられている。本研究では尿失禁に対する新規再生医療の開発に向けて、ヒト外尿道括約筋幹細胞の培養上清である「セクレトーム」を用いたrational確立に向けて様々な実験を行う。今年度は当教室で樹立した長寿化外尿括約筋細胞を用いて幹細胞から分泌されるセクレトーム解析のための上清回収・濃縮・バイオプレックスの実験を行う予定であった。しかし大学の改修工事に伴う実験の制約などによりセクレトーム解析を行う事が出来なかったため、今年度は新たな（女性の括約筋の分離を目指して）外尿道括約筋幹細胞の分離と長寿化細胞の樹立を行った。また、セクレトームが膀胱平滑筋細胞や線維芽細胞の増殖や細胞外マトリックスに与える影響を細胞培養系にて解析するために、初代培養のヒト膀胱平滑筋細胞及び線維芽細胞の分離培養を行った。インフォームドコンセントの得られた膀胱全摘症例より、手術時に外尿道括約筋組織外尿道括約筋の微量組織を細切し、コラゲナーゼ処理後に初代培養を行った。分離培養した外尿道括約筋幹細胞にCSII-CMV-TERTを遺伝子導入した。さらに横紋筋幹細胞マーカーであるCD56（NCAM）に対する蛍光抗体を用いてフローサイトメーターによって横紋筋幹細胞を分離し長寿化細胞株を樹立した。これまでに8例の外尿道括約筋組織の初代培養を行っており、4例に長寿化遺伝子を導入して3例の長寿化細胞株を樹立した。これらの細胞株については分化・増殖実験を行い横紋筋に分化することを確認した。同時に膀胱平滑筋細胞、線維芽細胞についても初代培養を行い同様に分離を行った。

外部尿道括约肌是围绕膜尿道的横纹肌肉，这有助于尿道禁忌症。但是，随着年龄的增长，外部尿道括约肌细胞正在减少，肌肉细胞被脂肪细胞和纤维组织取代，导致括约肌功能降低，这被认为是老年人尿失禁的因素。在这项研究中，将进行各种实验，以建立使用Soctionme（人类外部尿道括约肌干细胞的上清液）的理性，以准备开发新的再生尿失禁医学。今年，我们计划使用我们教室中建立的长寿命外尿括约肌细胞对干细胞分泌的秘密组进行分析，以进行上清液，富集和生物体验实验。但是，由于与大学翻新工作相关的实验限制，无法进行分泌分析，因此今年我们分离了新的外部尿道括约肌干细胞（目的是分离女性括约肌）并确定了寿命细胞。此外，为了分析秘密组对膀胱平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖以及使用细胞培养系统的细胞外基质的影响，分离和培养了人膀胱平滑肌细胞和成纤维细胞的主要培养物。如果通过知情同意进行总膀胱切除术，则在手术时切碎了外部括约肌组织的痕量组织，并在胶原酶处理后进行原发性培养。将CSII-CMV-TERT转染到分离的和培养的外尿道括约肌干细胞中。此外，使用针对CD56（NCAM）的荧光抗体，横纹干细胞标记物，通过流式细胞仪分离纹理的干细胞，并建立了寿命细胞系。迄今为止，已经对八例外尿道括约肌组织进行了主要培养，并引入了四例病例以建立三个寿命细胞系。这些细胞系被分化和增殖实验，以确认它们分化为横纹肌肉。同时，膀胱平滑肌细胞和成纤维细胞也被培养在原代培养物中，并以相同的方式分离。