悪性脳腫瘍に対するヒト脱落乳歯歯髄幹細胞を用いた新規腫瘍溶解ウイルス療法

使用人乳牙牙髓干细胞治疗恶性脑肿瘤的新型溶瘤病毒疗法

• 批准号: 22K09204
• 负责人: 小泉 慎一郎
• 金额: $ 2.41万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09204/
• 关键词: ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞; 腫瘍溶解ウイルス; グリオーマ幹細胞; 腫瘍溶解ウイルス療法; 悪性脳腫瘍

[グリオーマ幹細胞の培養増殖]：Massachusetts General Hospitalの脇本先生とMTA契約を締結して入手してあったグリオーマ幹細胞のMGG4, MGG8, MGG18, MGG23をそれぞれ幹細胞培養で増殖し、安定した継代・増殖のセットアップを確立した。ストックを作成した4種類のグリオーマ幹細胞をそれぞれ1×105 cellsずつヌードマウス脳内に投与し (n = 4)、MGGモデルマウスの作成に成功した。4種類のMGGモデルマウスでそれぞれ生存曲線を作成した。[腫瘍溶解ウイルス (oncolytic virus: OV)のセットアップ]：大臣確認実験の申請通過後、新規OVのHSV-P10およびRAMBOをそれぞれアフリカミドリザル腎臓由来のVero細胞に感染させ、ウイルスの複製・増殖を行った。複製したOVはスクロース遠心で精製し、他の実験に使用できるようにストックを作成した。[OVの抗腫瘍効果の検証]：精製したOVを段階的に感染多重度 (multiplicity of infection: MOI)を設定し、グリオーマ細胞株であるＵ-251およびLuciferase遺伝子を導入してあるU-87 MG-Luc2に感染させ、cell viability assayを行ってOVの抗腫瘍効果を確認した。[ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth: SHED)への感染実験]：精製したOVを段階的にMOIを設定してSHEDに感染させ、GFPの蛍光顕微鏡観察でSHED内でもOVが増殖しうることを確認した。また、OVを感染させたSHEDのcell viability assayを行い、SHEDに感染させる際のMOIの至適値を検証した。[腫瘍細胞とSHED-OVの共培養]：OVを感染させたSHED (SHED-OVとする)をグリオーマ腫瘍細胞株であるU-251およびU-87 MG-Luc2と共培養し、いずれの細胞でもOV単体の感染より優れた抗腫瘍効果を持つことが示唆された。

[胶质瘤干细胞培养扩增]：通过与马萨诸塞州总医院 Wakimoto 博士签订 MTA 合同获得的胶质瘤干细胞 MGG4、MGG8、MGG18 和 MGG23 在干细胞培养物中生长，以确保建立稳定的传代和扩增。我们通过将四种类型的神经胶质瘤干细胞各 1 x 105 个细胞注射到裸鼠 (n = 4) 的大脑中，成功创建了 MGG 模型小鼠。为四种类型的 MGG 模型小鼠分别创建了生存曲线。 【溶瘤病毒（OV）设置】：通过部委确认实验申请后，我们用新的OVs HSV-P10和RAMBO感染源自非洲绿猴肾脏的Vero细胞，病毒复制并增殖。通过蔗糖离心纯化复制的 OV，以创建用于其他实验的储备液。 【OV抗肿瘤作用验证】：阶段性设定纯化OV的感染复数（MOI），对导入荧光素酶基因的胶质瘤细胞系U-251和U-87进行抗肿瘤作用通过MG-Luc2感染和细胞活力测定证实OV。 [人脱落乳牙（SHED）干细胞的感染实验]：通过设定MOI，用纯化的OV感染SHED，并用荧光显微镜观察GFP，以检测SHED内的OV，确认它们可以增殖。此外，我们对OV感染的SHED进行了细胞活力测定，验证了感染SHED时MOI的最佳值。 [肿瘤细胞与SHED-OV的共培养]：将OV感染的SHED（简称SHED-OV）与胶质瘤肿瘤细胞系U-251和U-87 MG-Luc2共培养。表明其抗肿瘤效果优于单独感染OV。