オルガノイドを用いたメチル基転移酵素による肝内胆管癌リンパ節転移の機序解明

利用类器官阐明甲基转移酶引起的肝内胆管癌淋巴结转移的机制

基本信息

批准号：
22K08900
负责人：
速水晋也
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Wakayama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08900/
关键词：
肝内胆管癌 SMYD2 メチル化オルガノイド CRISPR/Cas9 メチル基転移酵素

项目摘要

i) 胆管癌オルガノイドの樹立がんオルガノイド「F-PDO」の胆管癌由来RBIL001-2 (F_PDO_000012) を用いて、F-PDOプロトコールに則り、専用の培養液Cancer Cell Expansion Media plus（032-25745, 富士フイルム和光純薬）にて継代、3D立体構造を確認した。ii) オルガノイドSMYD2発現解析－免疫化学染色樹立培養したRBIL001-2におけるSMYD2発現解析として免疫化学染色を行った。抗SMYD2抗体（mouse monoclonal, sc-393827; Santa Cruz Biotechnology）および二次抗体Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594; ab150116, abcam)を使用、当大学に設置されている共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZEISS Confocal Laser Scanning Microscope Model LSM780）にて観察した。iii) SMYD2抑制系実験システムの構築：CRISPR/Cas9によるSMYD2抑制系の構築オルガノイドにおけるSMYD2抑制系として、CRISPR/Cas9遺伝子改変技術を使用した。Manufacturers’ protocolに則り、Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)によるリポフェクタミン法でSMYD2 CRISPRプラスミド(h)（sc-403129; Santa Cruz Biotechnology）を導入した。免疫化学染色にてSMYD2の蛍光低下ないし消失を確認した。

i) 胆管癌类器官的建立使用癌类器官“F-PDO”的胆管癌来源的RBIL001-2（F_PDO_000012），专用培养基Cancer Cell Expansion Media plus（032-25745、032-25745、确认3D结构）使用富士胶片和光纯药工业株式会社ii)类器官SMYD2表达分析-免疫化学染色进行免疫化学染色以分析已建立的培养的RBIL001-2中的SMYD2表达。使用我们大学安装的共聚焦激光扫描系统，使用抗 SMYD2 抗体（小鼠单克隆，sc-393827；Santa Cruz Biotechnology）和二抗山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor® 594；ab150116，abcam）进行观察。使用显微镜（ZEISS 共焦激光扫描显微镜型号 LSM780）制作。 iii)SMYD2抑制系统实验系统的构建：利用CRISPR/Cas9构建SMYD2抑制系统利用CRISPR/Cas9基因修饰技术作为类器官中的SMYD2抑制系统。根据制造商的方案，使用 Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) 通过 lipofectamine 方法引入 SMYD2 CRISPR 质粒 (h)（sc-403129；Santa Cruz Biotechnology）。通过免疫化学染色证实SMYD2荧光的减少或消失。