IBMIR回避能を有するヒトiPS細胞肝芽創出による肝臓再構成の検討

通过创建具有 IBMIR 逃避能力的人 iPS 细胞肝芽来检查肝脏重建

• 批准号: 22K08729
• 负责人: 奥村 高志
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08729/
• 关键词: IBMIR; ヒトiPS細胞; 肝芽オルガノイド; 再生医療; 門脈内移植

本研究では、肝臓内への細胞移植の阻害要因の一つである即時型血液介在性炎症反応（IBMIR）の低減法の確立に向け、ゲノム編集による精度の高いIBMIR惹起機構の解明及びIBMIR惹起因子を欠損したヒトiPSC肝芽の移植評価を試みる計画である。令和4年度はまず、凝固カスケード因子のノックアウトiPS細胞株の樹立と評価を計画した。そのために、①実験動物に移植するヒトiPSC肝芽からIBMIR関連因子の発現を評価し、ノックアウトの対象とする遺伝子の選定を行った。また、②ゲノム編集技術により、IBMIRの上位に位置すると考えられる凝固カスケード構成因子（FactorIII等）を完全にノックアウトしたヒトiPS細胞の樹立を試みた。①については、実験動物に移植するヒトiPSC肝芽のサンプルを用いて、RNAシークエンスやマイクロアレイの発現解析を行った。その結果、凝固カスケード因子のFactorIIIに加え、補体など複数の炎症カスケード因子が、IBMIRの惹起に十分な発現を示すことを確認できた。さらに、ヒトiPSC肝芽は、報告のある複数のIBMIR抑制因子の発現が低いことも確認できた。加えて、発現量解析からノックアウトの対象となる候補遺伝子を数個に絞ることにもできた。そこで、②についてまず、凝固カスケードの主要構成因子であるFactorIIIのノックアウトiPS細胞株の樹立を試みた。その結果、片アリルのFactorIIIの機能欠損iPS細胞株を得ることに成功した。一方、両アリルの機能欠損株は得ることができなかった。今後は、ゲノム編集株の取得効率を上げるような方法改善を行い、完全にFactorIIIの機能を欠損したiPS細胞株の樹立を試みる予定である。

在本研究中，我们旨在通过基因组编辑和阐明高度准确的IBMIR诱导机制，建立一种减少立即血液介导的炎症反应（IBMIR）的方法，IBMIR是抑制细胞移植到肝脏的因素之一。我们计划评估缺乏该因子的人 iPSC 肝芽的移植。 2020财年，我们首先计划建立并评估凝血级联因子敲除iPS细胞系。为此，我们（1）评估了移植到实验动物体内的人iPSC肝芽中IBMR相关因子的表达，并选择了要敲除的基因。此外，（2）我们尝试使用基因组编辑技术建立人类iPS细胞，其中被认为位于IBMIR之上的凝血级联组成因子（因子III等）被完全敲除。对于①，我们使用移植到实验动物体内的人iPSC肝芽样本进行了RNA测序和微阵列表达分析。结果证实，除了凝血级联因子因子III之外，补体等几种炎症级联因子也充分表达以诱导IBMIR。此外，已证实人类 iPSC 肝芽中几种已报道的 IBMIR 抑制剂的表达水平较低。此外，通过表达水平分析，我们能够将要敲除的候选基因缩小到几个。因此，对于(2)，我们首先尝试建立因子III（凝血级联的主要组成部分）的敲除iPS细胞系。结果，我们成功获得了单等位因子 III 功能缺陷的 iPS 细胞系。另一方面，我们无法获得缺乏两种等位基因功能的菌株。未来，我们计划改进方法以提高获得基因组编辑细胞系的效率，并尝试建立完全缺乏因子III功能的iPS细胞系。