Induction of hypothalamic neurons by neuronal direct reporogramming

通过神经元直接重编程诱导下丘脑神经元

基本信息

批准号：
22K08637
负责人：
亀山俊樹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

まず、SFEBq法による視床下部神経細胞分化の際の遺伝子発現変化をRT-qPCRで詳細に解析を行った。SFEBq法により培養14日目に視床下部神経前駆細胞が生じるが、その後は、細胞を分散処理して平面培養（2Ｄ培養）条件下、またはセルカルチャー・インサート上でオルガノイド様細胞塊のまま（3Ｄ培養）培養を継続し、視床下部神経を分化・成熟させる。この際、2Ｄ培養下と3D培養下デバソプレッシン（AVP）神経の分化効率に違いがあることに着目した。そこでAVP神経以外の神経細胞についても分化効率を比較したところ、３Ｄ培養の方が高効率で分化する細胞種、反対に２Ｄ培養下の方が高効率で分化する細胞種、および２D培養でも３Ｄ培養でも分化効率は変わらない細胞種があることが明らかとなった。このことから、2D培養と3D培養は、単純に神経分化効率に差があるばかりでなく、神経細胞の特異性を生み出す機構にも差異が生じていることが推測された。この差異を明らかにするため、培養14日目視床下部神経前駆細胞（PRE）、2D培養および３Ｄ培養でそれぞれ28日後の細胞からTotal RNAを生成しRNA-seqによりトランスクリプトーム解析を行った。その結果、Notchシグナル関連因子の他、AVP神経やオキシトシン（OXT）神経の細胞に関与することが知られているOtpやPou3f2等複数の遺伝子の発現が2D培養下と3Ｄ培養下で変化していることが明らかとなった。一方で、視床下部神経ダイレクト・リプログラミング法の開発のため、今年度はES細胞（EB5細胞株）を用いて、視床下部神経細胞分化に必要な遺伝子群の組合せの検討を行った。その結果、ある転写因子の組合せによりAVP神経、OXT神経の分化を誘導する事に成功した。

首先，我们使用 RT-qPCR 的 SFEBq 方法对下丘脑神经元分化过程中的基因表达变化进行了详细分析。使用 SFEBq 方法在培养第 14 天生成下丘脑神经祖细胞，但之后，可以将细胞分散并在平坦表面上培养（2D 培养），或作为细胞培养插入物上的类器官样细胞簇（3D 培养）培养）。继续培养以分化和成熟下丘脑神经。此时，我们重点关注2D培养和3D培养下去血管加压素（AVP）神经元分化效率的差异。因此，当我们比较 AVP 神经元以外的神经元的分化效率时，我们发现某些细胞类型在 3D 培养中分化更有效，某些细胞类型在 2D 培养中分化更有效，而某些细胞类型在 2D 培养中分化更有效。人们清楚地知道有些细胞类型即使在培养时其分化效率也不会改变。这表明2D培养和3D培养之间不仅存在神经元分化效率的简单差异，而且产生神经元特异性的机制也存在差异。为了阐明这种差异，从培养14天后的下丘脑神经祖细胞（PRE）、2D培养28天和3D培养后的细胞生成总RNA，并通过RNA-seq进行转录组分析。结果，除了Notch信号相关因子外，已知与AVP神经和催产素（OXT）神经细胞有关的Otp和Pou3f2等多个基因的表达在2D和3D培养之间发生了变化。显然有。另一方面，为了开发下丘脑神经直接重编程方法，今年我们使用ES细胞（EB5细胞系）来检查下丘脑神经细胞分化所需的基因组合。结果，我们成功地使用转录因子的组合诱导 AVP 和 OXT 神经元的分化。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

空間的培養条件検討による視床下部神経分化誘導因子の探索

通过检查空间培养条件寻找下丘脑神经元分化诱导因子

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
鈴木つくし;塚本舜也;目良義也;久野萌花;河田美穂;小谷侑;斎藤加奈子;中島昭;亀山俊樹;長崎弘
通讯作者：
長崎弘

Molecular differences in the differentiation potential of hypothalamic neurons induced by different spatial culture conditions

不同空间培养条件诱导下丘脑神经元分化潜能的分子差异

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
鈴木つくし;塚本舜也;目良義也;久野萌花;河田美穂;小谷侑;斎藤加奈子;中島昭;亀山俊樹;長崎弘
通讯作者：
長崎弘

Characterization of hypothalamic MCH neuron development in a 3D differentiation system of mouse embryonic stem cells

小鼠胚胎干细胞 3D 分化系统中下丘脑 MCH 神经元发育的表征

DOI：
10.1523/eneuro.0442-21.2022
发表时间：
2022
期刊：
eNeuro
影响因子：
3.4
作者：
Yu Kodani;Kodani Y;Kawata M;Suga H;Kaneko YS;Nakashima A;Kameyama T;Saito K;Nagasaki H
通讯作者：
Nagasaki H

マウスES細胞を用いた遺伝子導入による視床下部室傍核神経の直接分化誘導

使用小鼠 ES 细胞通过基因转移直接分化下丘脑室旁核神经元