巨大血小板減少症と破砕赤血球症を伴う未知の先天性造血器疾患の原因解明

阐明与巨血小板减少症和片状红细胞增多症相关的未知先天性造血疾病的病因

• 批准号: 22K07921
• 负责人: 時政 定雄
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07921/
• 关键词: 巨大血小板; 破砕赤血球; ホスホリパーゼC; プロテインキナーゼC; adducin; F-アクチン; スペクトリン

われわれは先天的に巨大血小板と破砕赤血球を呈する貧血を伴う未知の造血器疾患を見出した。本例は既知の巨大血小板減少症の原因遺伝子に異常を認めず、エクソーム解析にて、phospholipase Cβ3 (PLCβ3) 遺伝子の異常が確認された。一般にphospholipase Cの働きによりPKCが活性化される。PKCには複数のサブタイプが存在し、赤芽球、巨核球にはともにPKCα、PKCδその他が発現していることが報告されている。また、PKC は血小板や赤血球において adducin をリン酸化し、リン酸化された adducin は F-アクチンとスペクトリンの分離を促して膜骨格に影響するという報告がある。本研究ではまず変異型PLCβ3の巨核球に対する影響がPKC阻害薬によってレスキューされるか検証する。次に血小板と赤血球の膜骨格を患者と正常ヒト細胞で比較する。さらに赤芽球、巨核芽球に分化可能な細胞株を用いてPLCβ3の血球分化における働きを調べ、新たな治療法の創出につなげる。まず巨大血小板減少症の原因を解析するため、マウス胎児肝細胞にレトロウイルスベクターを用いて変異型PLCβ3を導入し形質転換を行い、分化巨核球の胞体突起膨隆部数が減少することを確認した。本例のPLCβ3 変異は X-Y ドメインの近傍に位置し、機能が恒常的に活性化されることが推定され、実際、変異型PLCβ3は野生型と比べてPKCをより強く活性化することを示す実験結果を得た。次にPKCαとPKCδのそれぞれの阻害薬を用いて、変異型PLCβ3の巨核球に対する影響を評価したところ、PKCδ阻害薬で胞体突起膨隆部数の減少がレスキューされることを示唆する結果を得た。次にα、δ以外のPKCファミリーの阻害薬を用いて評価することを予定している。また、赤血球と血小板の細胞骨格蛋白を蛍光抗体染色するための準備を行った。

我们发现了一种以前未知的造血系统疾病，表现为贫血，表现为巨大血小板和片状红细胞。在该病例中，已知的巨血小板减少症致病基因未发现异常，外显子组分析证实磷脂酶Cβ3（PLCβ3）基因存在异常。一般来说，PKC是由磷脂酶C的作用激活的。据报道，PKC有多种亚型，红细胞和巨核细胞均表达PKCα、PKCδ等。此外，据报道，PKC 磷酸化血小板和红细胞中的内收蛋白，磷酸化的内收蛋白促进 F-肌动蛋白和血影蛋白的分离，从而影响膜骨架。在本研究中，我们将首先验证突变型PLCβ3对巨核细胞的影响是否可以被PKC抑制剂挽救。接下来，我们将比较患者和正常人体细胞之间的血小板和红细胞的膜骨架。此外，我们将利用可分化为成红细胞和巨核细胞的细胞系研究 PLCβ3 在血细胞分化中的作用，从而创造新的治疗方法。首先，为了分析巨血小板减少症的原因，我们使用逆转录病毒载体将突变型PLCβ3导入小鼠胎儿肝细胞中并进行转化，并确认分化的巨核细胞中的细胞突起的数量减少。本例中的PLCβ3突变位于X-Y结构域附近，推测其功能是组成型激活的。事实上，实验表明突变型PLCβ3比野生型更强烈地激活PKC。接下来，我们使用 PKCα 和 PKCδ 抑制剂来评估突变型 PLCβ3 对巨核细胞的影响，结果表明 PKCδ 抑制剂可以挽救细胞凸起数量的减少。接下来，我们计划使用 α 和 δ 以外的 PKC 家族抑制剂进行评估。此外，还制备了红细胞和血小板的细胞骨架蛋白的荧光抗体染色的制剂。