αアクチニン3欠損はDMD患者のiPS由来心筋細胞においてタイチン分解を促進する

α-肌动蛋白3缺乏促进DMD患者iPS来源的心肌细胞中肌动蛋白的降解

基本信息

批准号：
22K07913
负责人：
粟野宏之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07913/
关键词：
Duchenne型筋ジストロフィー心筋細胞 αアクチニン3 タイチン iPS細胞

项目摘要

本年度は末梢単核球由来細胞からiPS細胞を樹立、iPS細胞の心筋細胞への分化について実験を行った。初めに、iPS細胞樹立から心筋分化のプロトコールの決定のため、健常人サンプルを用いて実験を行った。健常人の末梢血単核球に、センダイウイルスベクターを用いて４因子（Klf-4, Oct3/4, Sox2, C-myc）を導入し培養を行った。マーカー遺伝子の発現の確認を行い、iPS細胞を樹立できることを確認した。次に、樹立したiPS細胞から心筋細胞へ分化の検討を行った。当初は、心筋の成熟マーカーの発現が弱い心筋細胞のみ得られ、成熟度が高い心筋細胞を得ることが困難であった。また、結合組織や血管細胞と思われる心筋以外の細胞も発生する問題があった。そのため、培地の選択、培養液の組成や培養条件の組み合わせについて何度も検討を行ったところ、成熟マーカーの発現があり、拍動が確認される成熟心筋細胞を得れた。これによりiPS細胞から心筋細胞への分化プロトコールの決定ができた。次に、Duchenne型筋ジストロフィーの患者３名から末梢血を採取した。３名の内訳は、αアクチニン3欠損患者が１名、非欠損患者が２名である。このうち、αアクチニン3非欠損患者1名においてiPS細胞のマーカー遺伝子の発現や三胚葉分化について評価が終了し、iPS細胞を樹立している。もう一人の非欠損患者については、マーカーや分化の確認を行っている。欠損患者は現在細胞の培養中である。iPS細胞を樹立した患者では、決定した分化プロトコールを用い心筋細胞に分化を行った。

今年，我们从周围单核细胞建立了IPS细胞，并进行了有关IPS细胞分化为心肌细胞的实验。首先，使用健康样品进行实验，以确定与IPS细胞建立的心肌分化方案。使用仙台病毒载体并培养了四个因素（KLF-4，OCT3/4，SOX2，C-MYC），将健康人的外周血单核细胞引入。确认了标记基因的表达，并确认可以建立IPS细胞。接下来，我们研究了已建立的IPS细胞对心肌细胞的分化。最初，仅获得心肌成熟标记表达弱的心肌细胞，因此很难获得高成熟的心肌细胞。还存在一个问题，即心肌以外的其他细胞也被认为是结缔组织和血管细胞。因此，在对培养基的选择进行了许多研究之后，培养基的组成以及培养条件的结合，我们发现成熟的心肌细胞表现出成熟标记的表达并确认殴打。这允许确定从IPS细胞到心肌细胞的分化方案。然后从三名Duchenne肌肉营养不良的患者中收集外周血。这三个患者的崩溃是1名患有α-肌动蛋白3缺乏症的患者，有2例没有缺乏症的患者。其中，评估了一名没有α-肌动蛋白3的患者在IPS细胞中的标记基因表达，并建立了IPS细胞。已确认另一位非缺陷患者的标记和分化。有缺陷的患者目前正在细胞培养中。在建立IPS细胞的患者中，使用确定的分化方案进行了分化为心肌细胞。