HIV-1粒子形成に至るGag複合体の実体解明

阐明导致 HIV-1 颗粒形成的 Gag 复合物

基本信息

批准号：
22K07102
负责人：
駒貴明
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07102/
关键词：
Gag HIV-1 多量体形成集合粒子形成液-液相分離

项目摘要

HIV-1粒子は集合過程において、骨格を形成するGag前駆体（以後Gag）が細胞膜で多量体を形成することにより起こるが、その初期過程（重要な3つのステップ：Gag二量体化、Gag膜移行、GagとgRNAの結合）は不明な点が多い。本研究課題ではGag集合過程で認められる複合体の実態を明らかにするために、まずそれぞれ初期過程で重要な上述3つのステップが阻害される変異体（Gag二量体化不全WMAA変異体、Gagミリストイル化不全G2A変異体、gRNA結合不全NC変異体）を構築し、Gag複合体について解析を行なった。WMAAを用いたMembrane flotation assayの結果、Gagの二量体化が阻害されると膜へ行く効率が半減した。またG2A変異体を用いたCloss-link assayの結果、二量体以上の多量体形成が阻害されていた。すなわち、まず細胞質内でGag二量体化の大部分が起こり、次に膜移行・膜結合すると考えられた。WMAA変異体やG2A変異体のGagもgRNAと結合することが知られているため、gRNAは決まった時点ではなく、出芽までの過程でGagに結合すると考えられた。そこで次にNC変異体について同様の解析を実施した結果、gRNAとの結合の有無は膜移行に関与しないこと、またCloss-link assayで確認できる6量体形成までは進んでいることが明らかになった。次にNC変異体のVelocity sedimentation assayを実施した結果、10Sや80S複合体は観察されたが、500S/750S複合体の割合が顕著に低下していることが明らかとなり、gRNAとの結合は高次でのGag多量体形成に重要であることが示唆された。これまでの報告と合わせると、10S複合体、80S複合体はGagの2量体化、膜移行、gRNAとの結合に関与ないことが明らかとなった。

HIV-1颗粒在组装过程中发生时，当骨骼堵嘴前体（以后的堵嘴）在细胞膜处形成多聚体，但是初始过程（三个重要步骤：插入二聚体二聚体，堵嘴膜转移以及堵嘴和GRNA结合）是未知的。在本研究主题中，为了阐明在堵嘴组装过程中观察到的复合物的实际状态，我们首先构建了突变体（插入二二聚体 - 完整的WMAA突变体，gag myristoylation-oferty-oferty-ofterte-ofterte g2a突变体，GRNA成分的NC突变体），在初始过程中很重要，并在初始过程中分析了GAG复合物。由于使用WMAA的膜浮选测定法，抑制堵塞二聚化降低了膜行进的效率。此外，由于使用G2A突变体的链接测定法，抑制了多聚体的多聚体的形成。也就是说，人们认为大多数插科打dimeration首先发生在细胞质内，然后是膜易位和膜结合。由于GAG，WMAA和G2A突变体也已知与GRNA结合，因此人们认为GRNA在当时而不是在固定时间点时与GAG结合。接下来，对NC突变体进行了类似的分析，并发现与GRNA结合的存在或不存在与膜转运无关，并且己酰胺的形成已通过链接链接测定法进行了证实。接下来，进行了NC突变体的速度沉积测定法，尽管观察到了10s和80s的配合物，但据揭示了500S/750S复合物的比例显着降低，这表明与GRNA的结合对于较高顺序的GAG多聚体形成很重要。结合以前的报道，已经揭示了10s和80s的复合物与堵塞二聚体，膜转移或与GRNA的结合无关。