原虫におけるミリストイル化タンパク質の輸送メカニズムの解明

阐明原生动物中肉豆蔻酰化蛋白的转运机制

基本信息

批准号：
22K07050
负责人：
中野由美子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07050/
关键词：
赤痢アメーバ Rab GTPase メンブレントラフィック membrane traffic protozoa

项目摘要

病原体の細胞表面タンパク質は、宿主認識や組織への侵入に関与する。一般的に分泌タンパク質にはN末端にシグナルペプチドが存在し、小胞を介して細胞外に分泌される。しかし、シグナルペプチド非依存型の分泌タンパク質も病原体や宿主細胞で報告されている。申請者は、赤痢アメーバの100種以上に多様化したRab GTPaseのうち、Rab2 isotypeがC末端ではなくN末端に脂質修飾を受ける可能性があることを見出しており、Rab2 isotypeの輸送の特殊性を明らかにすることが目的とする。赤痢アメーバのRab2ファミリーは3つのアイソタイプから構成される。EhRab2Aは785, EhRab2Bは214,EhRab2Cは232アミノ酸残基である。RNAseq解析を行うと、EhRab2Aの発現は非常に低く、EhRab2BとEhRab2Cの発現は低いものの、栄養体での発現が確認された。ゲノムデータベース情報では、いずれも転写開始メチオニンの直後にイントロンが存在している。特にEhRab2AはN末端にkinase domainが融合して発現しているのが観察された。EhRab2AとEhRab2Bは赤痢アメーバとその近縁種E. nuttaliあるいはE. moshkovskiiに存在するが、EhRab2Cは系統的に離れたE. invadensには存在せず、哺乳動物に特異的なEntamoeba に存在していると考えられた。またEhRab2CはN末端に疎水性の伸長配列が存在した。EhRab2ファミリーにはC末にシステイン残基はなく、N末にシステインが２つ存在する。このN末のシステインはSパルミトイル化されることを複数の予測モデルで確認した。EhRab2Bがパルミトイル化されるなら、膜に局在が確認できると考え、EhRab2B-GFP融合を発現する形質転換アメーバ株を作成したところ、GFPの局在は可溶性画分に観察された。融合したGFPの分子量が大きく、EhRab2Bの膜局在に阻害的に作用したことを考慮し、浸水性で小さなFLAGタグを融合することを試みている。

病原体的细胞表面蛋白参与宿主识别和组织侵袭。分泌蛋白通常在其N末端具有信号肽并通过囊泡分泌到细胞外。然而，在病原体和宿主细胞中也报道了不依赖于信号肽的分泌蛋白。申请人发现，在溶组织内阿米巴中已多样化为100多种的Rab GTPase中，Rab2同种型可能在N端而不是C端进行脂质修饰，目的是澄清。溶组织内阿米巴的 Rab2 家族由三种同种型组成。 EhRab2A具有785个氨基酸残基，EhRab2B具有214个氨基酸残基，EhRab2C具有232个氨基酸残基。 RNAseq分析显示EhRab2A的表达量很低，EhRab2B和EhRab2C的表达量也很低，但证实了它们在滋养体中的表达。根据基因组数据库信息，在转录起始甲硫氨酸之后立即存在内含子。特别是，观察到 EhRab2A 的表达带有融合到其 N 末端的激酶结构域。 EhRab2A 和 EhRab2B 存在于溶组织内阿米巴及其相关物种 E. nuttali 或 E. moshkovskii 中，但 EhRab2C 不存在于系统发育较远的入侵阿米巴中，但存在于哺乳动物特有的内阿米巴中。 EhRab2C 在其 N 末端也有一个疏水性延伸序列。 EhRab2家族的C端没有半胱氨酸残基，N端有两个半胱氨酸。使用多个预测模型证实该N端半胱氨酸是S-棕榈酰化的。我们认为，如果 EhRab2B 被棕榈酰化，它将定位在膜中，当我们创建表达 EhRab2B-GFP 融合体的转化阿米巴菌株时，我们观察到 GFP 定位在可溶部分中。考虑到融合的GFP分子量较大，对EhRab2B的膜定位有抑制作用，我们尝试融合一个小的、透水的FLAG标签。