Functional elucidation of novel effectors of Legionella pneumophila approached through interactions with unique ciliate

通过与独特纤毛虫的相互作用来阐明嗜肺军团菌新型效应子的功能

基本信息

批准号：
22K07051
负责人：
大久保寅彦
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07051/
关键词：
微生物間相互作用レジオネラ繊毛虫

项目摘要

(1) 未知エフェクターの検出：作出済みのトランスポゾン挿入変異Legionella pneumophila (Lp) 菌株と繊毛虫Anteglaucomaの共培養実験を実施し、変異株全体(n=782)の約半数となるNo.360まで共培養実験を完了した。その結果、これまでに発見していた13株に加えて新たに11株の病原性喪失株（繊毛虫を殺滅しなくなった株）を選抜した。AP-PCR法とシークエンスによってこれら11株のトランスポゾン挿入部位を確認した結果、5株で特定に成功し、いずれもⅣ型分泌装置に関連するicm遺伝子（icmB, icmC, icmE, icmGのいずれか）が機能不全になっていたことがわかった。これらは繊毛虫に対するLpの病原性遺伝子だと考えられるが、LpがⅣ型分泌装置を介して宿主にエフェクター蛋白を注入することは既に判明しているので、今回発見した遺伝子はいずれも既知のメカニズム（Ⅳ型分泌装置依存的）に関連すると考えられ、未知の病原性遺伝子を発見するには至らなかった。(2) ヒト細胞への病原性を確認するためにHeLa細胞とLp変異株の共培養を実施した。研究計画調書の段階ではTHP-1細胞の使用を予定していたが、まずは培養が簡易なHeLa細胞でスクリーニングを実施することとしている。上記で新たに病原性遺伝子を特定した5株をHeLa細胞と共培養した結果、元株(Lp JR32)と比べて生細胞率が上昇した。また、Lp変異株は元株と比べてヒト細胞内での集塊形成（蛍光顕微鏡観察）と細胞内生菌数（培養・qPCR）が有意に減少しており、病原性遺伝子の喪失によってヒト細胞内での増殖能が失われたことが確認できた。以上を踏まえると、今回見出したLpの病原性因子は繊毛虫とヒト細胞の双方に作用するものであることが示された。

（1）检测未知效应子：在转座子插入突变突变体肺炎军团菌株（LP）菌株和纤毛链球瘤上进行共培养实验，并完成了共培养实验，最高为360号，大约是总突变体应变的一半（N = 782）。结果，除了到目前为止发现的13种菌株外，还选择了11种新的致病性（不再杀死纤毛的海峡）。我们通过AP-PCR和测序证实了这11种菌株的转座子插入位点，发现五个菌株已成功鉴定，并且与IV型分泌装置（ICMB，ICMB，ICME或ICMG）相关的ICM基因具有功能障碍。这些被认为是针对纤毛的LP的致病基因，但已经发现LP通过IV型分泌装置注射效应蛋白在宿主中，因此这次发现的任何基因都被认为与已知机制有关（依赖于IV型分泌设备），并且我们无法发现未知的理性基因。（2）进行HeLa细胞和LP突变菌株的共培养，以确认人类细胞的致病性。尽管计划在研究计划报告中使用THP-1细胞，但该公司将首先筛选易于培养的HeLa细胞。具有新鉴定的病原基因的五个菌株与HeLa细胞共培养，与原始菌株相比，活细胞速率增加（LP JR32）。此外，与原始菌株相比，LP突变菌株显着降低了人类细胞中的荧光素（荧光显微镜）的形成（荧光显微镜）和内生细菌（培养/QPCR）的数量，并且已经证实，致病基因的丧失会导致人类细胞中繁殖的丧失。基于上述情况，已经表明，我们发现的LP的致病因子都作用于纤毛和人类细胞。