エピゲノム編集技術によるレット症候群の新規治療方法の開発

利用表观基因组编辑技术开发雷特综合征新治疗方法

基本信息

批准号：
22K06896
负责人：
堀家慎一
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06896/
关键词：
レット症候群エピゲノム編集エピジェネティクス

项目摘要

レット症候群（RTT）は，女児に発症する神経発達障害であり，X染色体上のMeCP2遺伝子変異が原因である。これまでの研究で，MeCP2の機能不全はターゲットとなる下流遺伝子の発現変化を誘発し，筋緊張の低下やてんかん・側弯・知的障害などの多彩な症状を引き起こす。興味深いことに，ヒトの生後半年程度に相当する3週齢のMecp2-KOマウスに正常なMecp2を補うと運動障害の改善が認められたことから，RTT患者でも正常MeCP2の適切量を補うことでRTTの治療の可能性が示唆された。すなわち，RTT患者にアデノ随伴ウイルス（AAV）で正常なMeCP2を導入することは，RTTの有効な治療手段と考えられるが，一方でMeCP2の過剰はMeCP2重複症候群を引き起こすことが知られている。したがって，RTTの治療においてMeCP2の正確な遺伝子量コントロールが要求されるが、AAVで導入した外来遺伝子の量的コントロールは非常に難しく，脳部位特異的なMeCP2遺伝子量を担保することが困難である。そこで本研究では，RTT患者が持つ正常なMeCP2をエピゲノム編集によって活性化させることによる機能回復をめざす。本年度は，MeCP2遺伝子の転写調節領域に関しては，ルシフェラーゼアッセイによりMeCP2転写開始点から「-179bp~-309bp」の領域がMeCP2遺伝子のコアプロモーター領域であることを明らかにした。また，このコアプロモーター領域内の６つのCpGが不活性化X染色体特異的にメチル化されていることを見出した。そこで，この６つのCpGをエピゲノム編集のターゲットとし，４つのガイドRNAを設計し脱メチル化効率を神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞にて精査した。その結果，gRNA4を用いた際，約15%~20％の脱メチル化が誘導され，それに伴い，MeCP2遺伝子の発現が1.3倍に上昇することを明らかにした。

雷特综合征 (RTT) 是一种影响女孩的神经发育障碍，由 X 染色体上的 MeCP2 基因突变引起。此前的研究表明，MeCP2功能障碍会引起下游靶基因表达的变化，导致肌张力下降、癫痫、脊柱侧弯和智力障碍等多种症状。有趣的是，当给 3 周大的 Mecp2-KO 小鼠（相当于人类出生后约 6 个月）补充正常 Mecp2 时，运动缺陷得到改善，这表明了治疗 RTT 的可能性。换句话说，使用腺相关病毒（AAV）将正常的MeCP2引入RTT患者被认为是RTT的有效治疗方法，但已知过量的MeCP2会导致MeCP2重复综合征。因此，在RTT的治疗中需要精确控制MeCP2基因剂量，但AAV引入的外源基因的定量控制极其困难，很难保证脑区域特异性的MeCP2基因剂量。因此，在这项研究中，我们的目标是通过表观基因组编辑激活RTT患者中发现的正常MeCP2来恢复功能。今年，关于MeCP2基因的转录调控区，我们通过荧光素酶分析发现，MeCP2转录起始位点“-179bp至-309bp”的区域是MeCP2基因的核心启动子区域。我们还发现该核心启动子区域内的 6 个 CpG 在失活的 X 染色体上被特异性甲基化。因此，我们针对这6个CpG进行表观基因组编辑，设计了4个向导RNA，并检测了神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的去甲基化效率。结果显示，当使用gRNA4时，诱导了约15%至20%的去甲基化，结果MeCP2基因表达增加了1.3倍。