アダプタータンパク質とPDZタンパク質の相互作用がもたらすCDC-48の機能制御

接头蛋白和 PDZ 蛋白之间的相互作用带来 CDC-48 的功能控制

• 批准号: 22K06886
• 负责人: 山中 邦俊
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06886/
• 关键词: AAAシャペロン; CDC-48; PDZドメイン; AAAタンパク質; 線虫; 寿命

CDC-48は、極めて多岐にわたる機能に関わるAAAシャペロンである。Nドメインアダプター（20数種類）がそれぞれに特異的な基質を認識し、 C末端アダプター（数種類）が基質をどのように処理するかを規定している。しかしながらどのようにしてNドメインアダプターは自身の「特異的基質」を探し出すのかはいまだに明らかではない。線虫NドメインアダプターASPS-1の機能解析を行う過程で、ASPS-1-CDC-48複合体が、寿命や匂い感知機能に関わっていることを見出している。さらにそれぞれの経路において、PDZ結合モチーフタンパク質やPDZドメインタンパク質と相互作用することも発見している。まずCRISPR/Cas9法によりN末にFLAGタグを付加したASPS-1を発現する線虫を構築した。FLAGタグを利用した免疫沈降を行い、共沈物質のマス解析を行なった。DAF-18をはじめとするPDZドメインタンパク質は検出されなかった。逆にHAタグを付加したDAF-18を発現する線虫も構築し、同様に免疫沈降・共沈物質のマス解析を行ったが、ASPS-1やCDC―48は検出されなかった。PDZドメインタンパク質はASPS-1-CDC-48複合体の基質であるので、結合は弱くかつ一過的であると予想されることから、想定されることでもある。ユニークなことに、ASPS-1を免疫沈降した時にCDC-48は確かに検出されたが、CDC-4のさまざまなアダプターのどれもが検出されなかった。UFD-1に関しては、ウエスタンブロッティングによっても確認した。これは、ASPS-1は報告にあるようにCDC-48の解体因子でありデフォルト化に機能している可能性を示唆している。また、ASPS-1を対象とした免疫沈降実験から、翻訳にかかわる因子やリボソーム品質管理に関わる因子がいくつも検出された。

CDC-48 是一种 AAA 伴侣，涉及极其广泛的功能。 N 域适配器（超过 20 种类型）各自识别特定的底物，C 端适配器（多种类型）定义底物的处理方式。然而，目前尚不清楚 N 域适配器如何找到其“特定底物”。在对秀丽隐杆线虫N域适配器ASPS-1进行功能分析的过程中，我们发现ASPS-1-CDC-48复合物参与寿命和气味感知功能。此外，他们还发现它们在每个途径中与 PDZ 结合基序蛋白和 PDZ 结构域蛋白相互作用。首先，我们使用 CRISPR/Cas9 方法构建了表达 ASPS-1 的线虫，并在其 N 末端添加了 FLAG 标签。进行使用FLAG标签的免疫沉淀，并对共沉淀物质进行质量分析。未检测到包括 DAF-18 在内的 PDZ 结构域蛋白。相反，我们构建了表达HA标记的DAF-18的线虫，并类似地对免疫沉淀和共沉淀物质进行了质量分析，但未检测到ASPS-1和CDC-48。这是预期的，因为 PDZ 结构域蛋白是 ASPS-1-CDC-48 复合物的底物，因此预计结合是弱且短暂的。独特的是，虽然在免疫沉淀 ASPS-1 时确实检测到了 CDC-48，但没有检测到 CDC-4 的各种接头。 UFD-1 也通过蛋白质印迹法得到证实。正如报道的那样，这表明 ASPS-1 可能是 CDC-48 的分解因素，并且可能在违约中发挥作用。此外，针对 ASPS-1 的免疫沉淀实验检测到了许多涉及翻译和核糖体质量控制的因素。