Dose the SecinH3 suppress ABC transporters by a novel mechanism?

SecinH3 是否通过新机制抑制 ABC 转运蛋白？

• 批准号: 22K06746
• 负责人: 蓬田 伸
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tohoku Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06746/
• 关键词: K562; Doxorubicin耐性; P-タンパク質; 排出機能; SecinH3; ARF6; P-糖タンパク質; Sec7ドメイン阻害剤; GEF; ERMタンパク質

初めにSecinH3のP-gpの排出機能に対する用量依存性について検討したところ、SecinH3は2.7、5.4、10、15、30 μMと容量依存的に蛍光色素の排出を抑制し、IC50は約10.96 μMであった。次に、Doxorubicin耐性K562細胞（ADR）においてCytohesin2、GEP100、ARF6、ARF1の発現に違いがあるかをWestern blottingで検討した。その結果、ADRにおいてGEP100及びARF6のタンパク質の発現は増加しおり、GEP100は細胞質画分において、ARF6は膜・オルガネラ画分で顕著に増加していた。一方、Cytohesin2やARF1はADRにおいて、タンパク質の発現が低下しており、Cytohesin2は膜・オルガネラ画分において顕著に低下していた。しかしながら、これらタンパク質の発現にSecinH3は影響を与えなかった。次に、SecinH3がP-gpに直接作用し排出機能を抑制していると考え、P-gpを高発現させた昆虫培養細胞株Sf9の細胞膜vesicleを用いて蛍光色素の排出に対する影響を検討した。その結果、既知の阻害剤では100 μM（75.9％）、2 mM（38.9％）と排出を抑制したが、SecinH3は5（97.8％）、10（91.3％）、15（110.8％）、30（103.2％）μMのいずれの濃度においても蛍光色素の排出を抑制しなかった。このことから、SecinH3のP-gpへの直接作用については可能性が低いこと示唆された。P-gpの機能や発現にはERMタンパク質の関与が報告されていることから、網羅的解析で差が見られたmoesinとezrinについてmRNAの発現をリアルタイムPCRで検討した。その結果、ezrinではその変化は確認できなかったが、moesinはADRにおいて2倍以上の差が見られた。

首先，我们研究了secinh3对P-gp排泄函数的剂量依赖性，并发现Secinh3以2.7、5.4、10、15和30μM的容量依赖性方式抑制了荧光染料的排泄，并且IC50的排泄量约为10.96μm。接下来，我们使用蛋白质印迹研究了耐氧霉素的K562细胞（ADR）中细胞粘蛋白2，GEP100，ARF6和ARF1表达的差异。结果，ADR中GEP100和ARF6蛋白的表达增加，在膜/有孔中，GEP100在细胞质分数中显着增加，ARF6显着增加。另一方面，细胞粘蛋白2和ARF1在ADR中的蛋白质表达降低，而在膜和细胞器馏分中，细胞融合蛋白2显着降低。但是，secinh3对这些蛋白质的表达没有影响。接下来，我们认为SECINH3直接作用于P-gp并抑制排泄功能，并使用昆虫培养的细胞系SF9的细胞膜囊泡进行了对荧光染料排泄的影响，该细胞系SF9表达高P-gp。结果，已知的抑制剂在100μM（75.9％）和2 mm（38.9％）下抑制了荧光染料的排泄，而SECINH3并未以5（97.8％），10（91.3％），15（91.3％），15（110.8％）的浓度下抑制荧光染料的排泄。这表明SECINH3对P-gp的直接影响不太可能。由于已经在P-gp的功能和表达中报道了ERM蛋白的参与，因此通过实时PCR检查了MOESIN和EZRIN的MRNA表达和EZRIN的mRNA表达，它们在全面分析中有所不同。结果，没有观察到Ezrin的变化，但Moesin在ADR中的差异差异是两倍以上。