Dose the SecinH3 suppress ABC transporters by a novel mechanism?

SecinH3 是否通过新机制抑制 ABC 转运蛋白？

• 批准号: 22K06746
• 负责人: 蓬田 伸
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tohoku Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06746/
• 关键词: K562; Doxorubicin耐性; P-タンパク質; 排出機能; SecinH3; ARF6; P-糖タンパク質; Sec7ドメイン阻害剤; GEF; ERMタンパク質

初めにSecinH3のP-gpの排出機能に対する用量依存性について検討したところ、SecinH3は2.7、5.4、10、15、30 μMと容量依存的に蛍光色素の排出を抑制し、IC50は約10.96 μMであった。次に、Doxorubicin耐性K562細胞（ADR）においてCytohesin2、GEP100、ARF6、ARF1の発現に違いがあるかをWestern blottingで検討した。その結果、ADRにおいてGEP100及びARF6のタンパク質の発現は増加しおり、GEP100は細胞質画分において、ARF6は膜・オルガネラ画分で顕著に増加していた。一方、Cytohesin2やARF1はADRにおいて、タンパク質の発現が低下しており、Cytohesin2は膜・オルガネラ画分において顕著に低下していた。しかしながら、これらタンパク質の発現にSecinH3は影響を与えなかった。次に、SecinH3がP-gpに直接作用し排出機能を抑制していると考え、P-gpを高発現させた昆虫培養細胞株Sf9の細胞膜vesicleを用いて蛍光色素の排出に対する影響を検討した。その結果、既知の阻害剤では100 μM（75.9％）、2 mM（38.9％）と排出を抑制したが、SecinH3は5（97.8％）、10（91.3％）、15（110.8％）、30（103.2％）μMのいずれの濃度においても蛍光色素の排出を抑制しなかった。このことから、SecinH3のP-gpへの直接作用については可能性が低いこと示唆された。P-gpの機能や発現にはERMタンパク質の関与が報告されていることから、網羅的解析で差が見られたmoesinとezrinについてmRNAの発現をリアルタイムPCRで検討した。その結果、ezrinではその変化は確認できなかったが、moesinはADRにおいて2倍以上の差が見られた。

首先，我们研究了SecinH3对P-gp外排功能的剂量依赖性，发现SecinH3在2.7、5.4、10、15和30μM时以剂量依赖性方式抑制荧光染料的外排，并且IC50大约有10.96μM。接下来，使用Western blotting检测多柔比星耐药K562细胞（ADR）中Cytohesin2、GEP100、ARF6和ARF1的表达是否存在差异。结果，ADR中GEP100和ARF6蛋白的表达增加，并且细胞质部分中GEP100显着增加，膜/细胞器部分中ARF6显着增加。另一方面，ADR 中 Cytohesin2 和 ARF1 的蛋白表达降低，膜/细胞器组分中 Cytohesin2 显着降低。然而，SecinH3 对这些蛋白的表达没有影响。接下来，考虑到SecinH3直接作用于P-gp并抑制其排泄功能，我们利用高表达P-gp的培养昆虫细胞系Sf9的细胞膜囊泡研究了其对荧光染料排泄的影响。结果，已知抑制剂将外排抑制至 100 μM (75.9%) 和 2 mM (38.9%)，而 SecinH3 将排泄抑制至 5 (97.8%)、10 (91.3%)、15 (110.8%) 和 30 （在任何浓度 103.2%）μM 下，荧光染料的排泄均不受抑制。这表明SecinH3对P-gp直接作用的可能性较低。由于有报道ERM蛋白参与P-gp的功能和表达，我们使用实时PCR检查了moesin和ezrin的mRNA表达，综合分析显示出差异。结果，使用ezrin没有发现变化，但是观察到与moesin的ADR有两倍以上的差异。