基底膜タンパク質の局在決定機構と物理構造の必要性の解析

基底膜蛋白物理结构定位机制及必要性分析

• 批准号: 22K06209
• 负责人: 伊原 伸治
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Prefectural University of Hiroshima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06209/
• 关键词: 基底膜; 線虫; IV型コラーゲン; 細胞外マトリックス

本研究では、基底膜タンパク質の局在決定機構を明らかにするために、ゲノム編集技術を用いて、これまでに見出した局在異常を示すP1591S変異をもつIV型コラーゲンとin-frameでG2ドメインを欠損したナイドジェン（変異型ナイドジェン）の可視化を試みた。また、ナイドジェンの偏在化した局在がナイドジェンの発現量に依存するかを明らかにするために、体全体の体壁筋細胞で強い発現誘導するmyo-3プロモーター（L3幼虫期でも発現誘導は維持される）でナイドジェンの異所的な発現誘導を行い、L3幼虫期のナイドジェンの咽頭基底膜の局在変動の観察を行った。変異型IV型コラーゲンの可視化を行うために、生殖細胞でCas9が高発現する線虫を用いて内在性のIV型コラーゲンの可視化を試みたが、これまでに変異型IV型コラーゲンの可視化には成功していない。一方、変異型ナイドジェンは可視化に成功しており、G2ドメインが欠損した変異型ナイドジェンは腸管基底膜に殆ど局在しないことが明らかになった。さらにmyo-3プロモーターでナイドジェンを異所的に発現させると、L3幼虫期のナイドジェンの咽頭基底膜の局在変動が観察されなかった。またG2ドメインが欠損したナイドジェンの変異体では、IV型コラーゲン、ラミニン、へミセンチンの局在異常は観察されなかった。以上の結果より、ナイドジェンのG2ドメインが腸管基底膜に存在するために必要なこと、咽頭基底膜の局在変動は発現量に依存していること、ナイドジェンのG2ドメインの欠損は他の基底膜の局在決定に関与しないことが明らかになった。さらに基底膜の物理構造を変化させるためにハブ粗毒を用い基底膜の分解を試みた。現在、ハブ粗毒がどの基底膜を優先的に分解するのか、解析中である。

在这项研究中，为了澄清基底膜蛋白的定位确定机制，我们试图用P1591S突变可视化IV型胶原蛋白，该突变表现出定位异常，而使用基因组编辑技术则缺乏g2域的NIDOGEN。 Furthermore, in order to clarify whether the ubiquitously localized nidgen localization depends on the expression level of nidgen, we ectopic expression inducing nidgen using the myo-3 promoter that strongly induces expression in body wall myocytes throughout the body (expression induction is maintained even in L3 larval stage), and we observed localization of the pharyngeal basement membrane of nidgen during L3 larval 阶段。为了可视化IV型突变型胶原蛋白，我们尝试使用高度表达生殖细胞中Cas9的线虫来可视化IV型胶原蛋白，但是迄今为止，我们还没有成功地可视化IV型胶原蛋白。另一方面，突变的差异已成功地可视化，并且已经揭示了具有G2结构域的突变型nidogens很少位于肠道的地下膜上。此外，当异位用Myo-3启动子异位表达Nidgens时，在L3幼虫期在Nidgens的咽底膜中未定位变化。此外，在缺乏G2结构域的Nidogen突变体中未观察到IV胶原蛋白，层粘连蛋白或半月异常的异常。以上结果表明，尼德根的G2结构域必须存在于肠道的地下膜中，咽咽的基因膜中的定位变化依赖于表达的量，并且在NIDGEN的G2域中的缺陷不参与其他基础膜的本地化。此外，我们尝试使用轮毂粗毒素来分解基底膜以改变基底膜的物理结构。目前，我们目前正在分析哪种基底膜原油有毒优先分解。