脱リン酸化を介した神経細胞カルシウムシグナル全貌解明のための基盤研究

通过去磷酸化阐明神经元钙信号完整情况的基础研究

基本信息

批准号：
22K06139
负责人：
千村崇彦
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06139/
关键词：
シグナル伝達神経可塑性カルシウム

项目摘要

「カルシウムイオンがどのように神経可塑性を制御するのか?」この根源的な問いに答えるため、神経細胞に発現する蛋白質に着目し、その分子的特性を調節するリン酸化状態、特にカルシウム依存的に起こる脱リン酸化反応の制御機構を解明する。新規に発見した神経細胞における脱リン酸化反応と、それをin vitroで再現する独自に構築したin vitro脱リン酸化反応系を用い、以下の２点を主たる研究の柱として解析を進めている。(1)神経細胞に発現している機能未知分子として我々が独自に単離した新規蛋白質UF1が前述の脱リン酸化制御に果たす役割を明らかにすること、(2)当該脱リン酸化反応の標的となる新規な基質蛋白質を、質量分析などのプロテオミクス解析を用いて網羅的に探索し、脱リン酸化反応の全体像を明らかにすること。2022年度の進捗状況は以下の通りである。(1)UF1の生化学的特性の解析を行うため、大腸菌リコンビナント蛋白質精製条件の確立、及び生化学的アッセイ法の確立を重点的に進めた。リコンビナントUF1をGST融合蛋白質として精製条件を確立した。また、溶出に用いた還元型グルタチオン、及びGST蛋白質それ自体は脱リン酸化反応に影響を与えないことを確認し、GST融合蛋白質存在下でのin vitro脱リン酸反応の条件を確立した。当該条件においてGST-UF1の脱リン酸化反応に対する影響を計測したところ、UF1には脱リン酸化抑制活性があることが判明した。この発見は、神経細胞におけるシグナル伝達系の理解において極めて重要な知見である。(2)脱リン酸化反応の標的となる新規蛋白質の網羅的解析を進めるため、質量分析に供するサンプルの調製方法、蛋白質量の検討を進めた。マウス脳抽出液を用いる方法と、神経細胞の初代培養細胞の抽出液を用いる方法を比較し、前者の方が質的に優れた方法であることを確認した。

“钙离子如何控制神经抛光，以回答这一基本问题，重点是在神经细胞中表达的蛋白质并调整其分子特征，尤其是钙依赖性的蛋白质。使用新发现的神经细胞和诱导的磷酸化反应系统，这是一种独特的体外体外，可以在体外重现，以下两个点被分析为主要研究支柱。（1）在神经细胞中表达的功能是未知的分子，我们独立地分离的新蛋白UF1阐明了上述的DUG氧化控制的作用，（2）去除磷酸化氧化的目标是新的。使用蛋白质组学分析（例如质谱法）进行了探索，并阐明了去除LIN氧化的总体图像。 2022年的进展如下。（1）为了分析UF1的生化特征，建立了大肠杆菌重组蛋白纯化条件，并促进了生化测定的建立。 rICOMBINANS UF1作为GST融合蛋白建立。此外，已经证实，用于洗脱的谷胱甘肽还原，GST蛋白本身不影响氧化物反应的去除，并在存在GST融合蛋白的情况下确定了体外哑巴反应反应的状况。在这些条件下，测量了GST-UF1对降解的磷酸化反应的影响，并发现UF1抑制了去除氧化。这一发现是对神经细胞中信号传递系统的理解极为重要的发现。（2）为了进行新蛋白质的全面分析，这是LIN氧化反应的靶标，研究样品的方法以及质谱法的蛋白质量。将使用小鼠脑提取物与使用神经细胞的第一代培养细胞提取物的方法进行比较，前者证实了前者是一种更好的定性方法。