中性子回折を用いたSIRT5の脱スクシニル反応におけるプロトン移動経路解明

使用中子衍射阐明 SIRT5 脱琥珀酰化反应中的质子转移途径

• 批准号: 22K06108
• 负责人: 日下 勝弘
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Ibaraki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06108/
• 关键词: 中性子構造解析; Sirtuin5; プロトン移動

変異体SIRT5の脱スクシニル化活性の測定：SIRT5の活性に重要とされるアミノ酸に変異を導入したSIRT5(Q140L, N141V, H158M)の機能解析を行うことを目的とし、変異導入した遺伝子合成を行い、これを基にSIRT5変異体について 遺伝子組み換え大腸菌による発現、大腸菌破砕によりタンパク質の抽出および精製を行なった。これらの変異体について、基質結合と酵素反応におけるQ140,N141,H158の役割を明確にするために、ミカエリス-メンテン解析によってKmとKcatを得、野生型と比較することを試みた。現在、解析を進めている。中性子回折測定用大型結晶育成：中性子構造解析のための大型結晶育成を目的として、野生型SIRT5について、遺伝子組み換え大腸菌による発現、大腸菌破砕によりタンパク質の抽出および精製方法の確立を行ない、SIRT5の発現タンパク質の濃縮により、23.2mg/mLのタンパク質溶液を得ることができた。しかしながら、研究代表者の所属における実験環境に不備が生じたため、中性子構造解析の大型結晶育成のための結晶化条件検索や実際の大型結晶化に用いるのに十分な大量のタンパク質精製には至らなかった。結晶化に必要な試薬として、スクシニル化リシンscuprx1（配列：SKEYFS{Lys(suc)}Q K）のペプチド合成を行なった。大型結晶育成のためのタンパク質大量精製とそれを用いた結晶化条件の検索を今後進める予定である。中性子回折データ精度向上法開発：iBIXで得られる白色中性子回折データは単色よりデータ精度が低い傾向にある。波長依存性の対して適切に補正する新たな方法を開発することを目的とした初期検討を実施した。現在検討を継続している。

突变体SIRT5的脱琥珀酰化活性的测量：为了分析SIRT5（Q140L、N141V、H158M）的功能，其中对SIRT5活性重要的氨基酸发生突变，我们合成了突变基因，在此基础上我们表达了突变基因。重组大肠杆菌中的 SIRT5 突变体，并通过破坏大肠杆菌来提取和纯化蛋白质。为了阐明Q140、N141和H158在这些突变体的底物结合和酶促反应中的作用，我们通过Michaelis-Menten分析获得了Km和Kcat，并将它们与野生型进行比较。目前正在进行分析。用于中子衍射测量的大晶体的生长：为了生长用于中子结构分析的大晶体，我们在转基因大肠杆菌中表达野生型SIRT5，建立了通过破坏大肠杆菌的蛋白质提取和纯化方法，并开发了浓缩得到SIRT5表达蛋白23.2mg/mL的蛋白溶液。然而，由于主要研究人员所在机构的实验环境存在缺陷，无法寻找用于中子结构分析的大晶体生长的结晶条件或纯化足以用于实际大结晶的大量蛋白质。 。作为结晶所需的试剂，进行琥珀酰化赖氨酸scuprx1（序列：SKEYFS{Lys(suc)}Q K）的肽合成。我们计划继续对蛋白质进行大规模纯化，以生长大晶体，并利用这种纯化来寻找结晶条件。开发提高中子衍射数据精度的方法：使用 iBIX 获得的白色中子衍射数据往往比单色中子衍射数据具有较低的数据精度。进行了初步研究，目的是开发一种新方法来适当补偿波长依赖性。目前我们正在继续考虑这一点。