低分子量Gタンパク質N-Rasの脂質修飾制御の構造研究

低分子量G蛋白N-Ras脂质修饰调控的结构研究

• 批准号: 22K06110
• 负责人: 平野 良憲
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06110/
• 关键词: 転写後修飾; 翻訳後修飾; 低分子量Gタンパク質; Ras; パルミトイル化; 構造生物学

タンパク質の脂質修飾の１つS-パルミトイル化は可逆的な翻訳後修飾で、多くのタンパク質の細胞内局在、安定性や機能を制御しており、がん遺伝子やがん抑制遺伝子の機能制御に必須である。哺乳類においてパルミトイル化はZDHHCファミリーと呼ばれるS-アシル転移酵素により触媒される。一方、脱パルミトイル化はAPT1/2やABHD17等の加水分解酵素により触媒される。これらの酵素はがん遺伝子やがん抑制遺伝子の機能を調節しており、がんにおいては発現パターンに変化が見られため、S-パルミトイル化のダイナミクスを制御する酵素はがん治療薬の標的候補と考えられている。本研究では低分子量Gタンパク質N-RasのS-パルミトイル化ダイナミクスを制御に着目し、脂質修飾よるN-Rasの機能制御機構の理解やがん治療薬の創出に指向した研究展開のための基盤として、ZDHHC9やABHD17の構造解析を行い触媒機構や基質認識機構を原子レベルで明らかにすることで、シグナル伝達の理解、阻害剤の開発へ貢献することを目的としている。N-Rasのパルミトイル化酵素ZDHHC9は昆虫細胞および哺乳細胞発現系でタンパク質発現を試み、膜画分から可溶化する界面活性剤の種類・濃度の検討を行った。その結果、アクセサリータンパク質GCP16との共発現時に広範な界面活性剤で可溶化できる条件を確立した。ZDHHC9とGCP16を共発現した細胞の膜画分から界面活性剤で可溶化を行い、アフィニティー精製及びゲルろ過クロマトグラフィーで精製を行った。精製したタンパク質複合体についてクライオ電子顕微鏡での観察を行った。N-Rasの脱パルミトイル化酵素ABHD17については大腸菌発現系での発現系構築を試みた。ABHD17A, ABHD17Cについて種々のコンストラクトの検討を行った。種々のクロマトグラフィーを用いて高純度の試料を得た。精製したタンパク質について結晶化スクリーニングを行っている。

蛋白质的脂质修饰之一是S-Palmitoylation，是一种可逆的翻译后修饰，可调节许多蛋白质的亚细胞定位，稳定性和功能，对于致癌基因和癌症抑制基因的功能至关重要。哺乳动物中的棕榈酰化是由称为ZDHHC家族的S-酰基转移酶催化的。另一方面，deplimitoylation被水解酶（例如APT1/2和ABHD17）催化。这些酶调节癌基因和癌症抑制基因的功能，并在癌症中观察到表达模式的变化，因此控制S-五酰化动力学的酶被认为是癌症治疗的靶向候选者。这项研究的重点是控制低分子量G蛋白N-RAS的S--膜酰化动力学，并旨在通过了解通过脂质修饰的N-RAS的功能控制机制来促进抑制剂的发展，并通过开发旨在通过分析癌症治疗药物来识别ZDHHC9和ABHC9和ABHC9和ABHD17的研究，并开发旨在开发旨在开发癌症治疗药物的研究。原子水平。 N-RAS的棕榈酰ZDHHC9用于在昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统中表达蛋白质，研究了从膜级分溶于膜的表面活性剂的类型和浓度。结果，建立了与辅助蛋白GCP16共表达后可以用广泛的表面活性剂溶解的条件。共表达ZDHHC9和GCP16的细胞的膜分数被用表面活性剂溶解，并通过亲和力纯化和凝胶过滤色谱法纯化。在冷冻电子显微镜下观察到纯化的蛋白质复合物。对于N-RAS的Depalmitoylation酶ABHD17，我们试图在大肠杆菌表达系统中构建一个表达系统。检查了ABHD17A和ABHD17C的各种结构。使用各种色谱法来获得高纯度样品。纯化的蛋白质经受结晶筛选。