RNAアプタマーを利用したU2 snRNPの「ゆるい」ブランチ部位認識機構の解明

使用RNA适体阐明U2 snRNP的“松散”分支位点识别机制

• 批准号: 22K06105
• 负责人: 桑迫 香奈子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Musashino University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06105/
• 关键词: mRNAスプライシング; U2 snRNP; RNAアプタマー; pre-mRNAスプライシング

U2 snRNPは，mRNA前駆体のスプライシングにおいて，イントロン上のブランチ部位を認識して結合し，スプライシング反応の活性中心を形成する。ヒトでは，ブランチ部位とされる配列は複数あるが，これら複数のRNA配列をどのようにしてU2 snRNPが認識しているのかは未知である。本研究では，このU2 snRNPによる認識を「ゆるい」と定義して，この特徴的なRNA認識機構をRNAアプタマーを利用して解明する。本研究で利用するアプタマーがスプライシングに与える影響を確認するため，インビトロでのスプライシングアッセイ系の作製を試みた。基質となるmRNA前駆体は，T7 RNAポリメラーゼによる転写反応によって合成するため，鋳型のDNAをプラスミドの形で精製し，制限酵素処理によりRun-offさせられる形とした。現在，これを用いて転写反応を行い，その産物の確認を行っている。スプライシング反応を起こすために必要なスプライシング因子は，核抽出物を用いる。いくつかの文献で市販の核抽出物が使われているため，同じものを購入して利用する予定である。スプライシング制御因子がU2 snRNPに結合することで，選択的スプライシングに影響を与えることが示唆されている。そこで特定の制御因子に注目し，大腸菌を宿主とした発現系の構築を試みたが，成功しなかった。今後はこれを継続させて，無細胞タンパク質合成系の利用を試みる予定である。また，全長ではなく，相互作用に関与する部位に注目して発現系を構築することも検討する。

在mRNA前体的剪接时，U2 SNRNP识别并结合内含子上的分支位点，形成了剪接反应的活动中心。在人类中，有多种序列被认为是分支位点，但是U2 SNRNP如何识别这些多个RNA序列是未知的。在这项研究中，我们将U2 SNRNP的识别定义为“松动”，并使用RNA适体阐明了这种独特的RNA识别机制。为了确认本研究中使用的适体对剪接的影响，我们试图创建一个体外剪接测定系统。通过与T7 RNA聚合酶转录反应合成作为底物的mRNA前体，因此以质粒的形式纯化了模板DNA，并通过限制酶处理径流。目前，这用于执行转录反应并确认产品。核提取物用作引起剪接反应所需的剪接因子。由于几篇文献使用了市售的核提取物，因此我计划购买相同的核提取物并使用它们。已经提出，剪接调节剂与U2 SNRNP的结合会影响替代剪接。因此，我们专注于特定的调节因素，并试图以大肠杆菌作为宿主构建表达系统，但这并不成功。我们计划将来继续使用它，并尝试使用无细胞的蛋白质合成系统。我们还将考虑通过专注于相互作用而不是全长的站点来构建表达系统。