光操作を用いた不整脈モデル動物の創出による心臓拍動制御メカニズムの解明

通过使用光学操作创建心律失常模型动物来阐明心跳控制机制

• 批准号: 22K06072
• 负责人: 森川 久未
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06072/
• 关键词: 光遺伝学; 光操作型Cre組換え酵素; iPS細胞; マウスモデル; 不整脈; 疾患モデル

本研究では心臓の不整脈の一種である徐脈性不整脈を、光遺伝学技術を用いて再現することを目的にしている。このための技術開発として、2022年度は、(1) マウスモデルを用いた光操作技術の確立と、(2) ヒトiPS細胞におけるPA-Cre恒常発現細胞株の樹立および光照射によるCre-loxP組換えの確認について研究を進めてきた。(1) については、マウス初期胚において光照射によるCre-loxP組換え手法の確立を行った。特にマウス系統の最適化と、光照射のタイミングを検討した結果、初期胚における青色光照射特異的Cre-loxP組換えの条件を確立できた。(2) については、PA-Creを恒常発現するpiggyBACベクターをhiPS細胞（409B2株）へ遺伝子導入し、細胞株を樹立した。青色光照射によるスクリーニングにより、青色光照射時の組換え効率が最も高く、暗所時での自発的組換え（dark leak）が低い細胞株を選別した。このPA-Cre恒常発現iPS細胞株を心筋細胞へ分化誘導した結果、拍動する心筋細胞を得ることができた。さらに分化誘導した心筋細胞に、青色光照射を行うと、照射部位に限定してCre-loxP組換えとレポーターの赤色蛍光タンパク質の発現を確認することができた。加えて、分化誘導途中で青色光照射を行った際にも、照射細胞を赤色蛍光レポーターの発現で追跡できることが分かった。以上より、PA-Creを恒常発現するヒトiPS細胞株の樹立に成功し、光照射細胞を永続的に追跡できる実験系を確立した。

这项研究旨在使用光遗传技术复制心动过缓（一种心律不齐的类型）。作为为此目的的技术开发，在2022财年，我们一直在研究（1）使用小鼠模型来建立光持调技术，以及（2）建立在人IPS细胞中表达PA-CRE稳态的细胞系，并通过光照射确认CRE-LoxP重新组合。关于（1），我们通过早期小鼠胚胎中的光照射建立了一种Cre-loxP重组技术。特别是，研究了小鼠菌株的优化和光照射的时间，并建立了早期胚胎中蓝光特异性CRE-LoxP重组的条件。对于（2），组成型表达PA-CRE的PiggyBac载体被转染到臀部细胞（菌株409b2）中，并建立了细胞系。用蓝光照射筛选允许细胞系在蓝光照射期间选择最高的重组效率，并在黑暗中选择最低的自发性黑暗泄漏。该PA-CRE稳态表达的IPS细胞系被诱导到心肌细胞中，并获得了脉动心肌细胞。此外，当用蓝光，CRE-LOXP重组辐射在分化中诱导的心肌细胞时，只能在辐照部位证实记者的红荧光蛋白的表达。此外，发现即使在诱导分化过程中辐照蓝光时，也可以通过表达红色荧光报告基因的表达来跟踪受照射的细胞。从以上，我们成功建立了不断表达PA-CRE的人IPS细胞系，并建立了一个可以永久跟踪光辐照细胞的实验系统。

项目成果

光遺伝学技術: PA-Cre3.0による生命現象の時空間解析手法の確立

光遗传学技术：利用PA-Cre3.0建立生物现象时空分析方法

• 发表时间: 2022
• 作者: Cheng Keren;Seita Yasunari;Moriwaki Taku;Noshiro Kiwamu;Sakata Yuka;Hwang Young Sun;Torigoe Toshihiko;Saitou Mitinori;Tsuchiya Hideaki;Iwatani Chizuru;Hosaka Masayoshi;Ohkouchi Toshihiro;Watari Hidemichi;Umazume Takeshi;Sasaki Kotaro;森川久未
• 通讯作者: 森川久未

光遺伝学手法：PA-Cre3.0によるヒトiPS細胞・初期発生の遺伝子操作技術の開発

光遗传学方法：人类iPS细胞基因操作技术的开发以及使用PA-Cre3.0的早期开发

• 发表时间: 2022
• 作者: 森川久未;孫略
• 通讯作者: 孫略

産業技術総合研究所 細胞分子工学研究部門 ステムセルバイオテクノロジー研究グループ

产业技术综合研究所细胞分子工程研究部干细胞生物技术研究组