魚類には「ない」遺伝子の導入による魚類由来培養細胞株の老化耐性メカニズムの解明

通过引入鱼类中未发现的基因阐明鱼类来源的培养细胞系的抗衰老机制

• 批准号: 22K05818
• 负责人: 二見 邦彦
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tokyo University of Marine Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05818/
• 关键词: p16; SASP; SA-β-gal活性; 完全老化; 魚類細胞; 細胞老化

哺乳類では，癌遺伝子産物Rasはp53経路とp16経路の両方を活性化することで細胞老化を誘導する。魚類はp16を欠如しているため，Rasの活性化のみでは魚類細胞は完全老化に成熟できない。そこで本研究では，魚類には「ない」p16遺伝子とras遺伝子を魚類由来培養細胞株EPCに共導入し，完全老化誘導を試みることで，その老化耐性メカニズムを解明することを目的とした。ヒトp16を単独でトランスフェクションしたEPC細胞において，細胞老化マーカーであるSA-β-gal活性の上昇と，SASP（細胞老化随伴分泌現象）因子をコードする遺伝子（il1b，il6，cxcl8a）の発現上昇が確認された。申請前に行った予備実験では，p16を単独で導入した細胞ではSASP因子の発現上昇は確認できなかったが，これは，選択用抗生物質G418によるセレクションが行われていなかったため，一過性の導入ではp16を発現する細胞が少なかったことが理由であると推察された。次に，市販のバイシストロン性発現プラスミドベクター（pIRES）およびバイディレクショナル発現ベクター（pBI）を用いてp16 とドミナントネガティブ変異体Ras（RasN17）を同一プラスミドから翻訳させるシステムの構築を試みた。その結果，魚類細胞ではIRESは機能せず，ColE1 oriを持つpBIはpUC oriを持つpIRESに比べてコピー数が少なく，トランスフェクションに十分な量のプラスミドを抽出できなかった。少なくとも魚類のゲノムにp16が存在しないことが魚類の細胞株が完全老化に対して耐性をもつことの重要な決定要因の一つではあるものの，p16によって誘導される完全老化にRasの活性化が必要どうかについては明らかにできなかった。

在哺乳动物中，癌基因RAS通过激活p53和p16途径来诱导细胞衰老。由于鱼缺乏p16，因此鱼细胞无法通过激活Ras单独完成衰老。因此，在这项研究中，目的是通过将p16基因和RAS基因共同引入培养的鱼类衍生的细胞系EPC，并试图诱导完全衰老来阐明衰老抗性的机制。在单独用人p16转染的EPC细胞中，SA-β-GAL的活性，细胞衰老标记物的活性以及编码SASP（细胞衰老相关的分泌现象）因子（IL1B，IL6，CXCL8A）的基因的表达。在应用之前进行的初步实验中，SASP因子的表达因素在单独使用P16引入的细胞中没有证实，但这是因为这是因为使用选择抗生素G418进行了未选择，并且在瞬时诱导过程中表达P16的细胞很少。接下来，我们尝试构建一个系统，其中使用市售的双散发性表达质粒载体（PIRES）和双向表达载体（PBI）从相同的质粒中翻译了P16和显性负突变体Ras（RASN17）（RASN17）。结果，IRE在鱼类细胞中没有起作用，而具有Cole1 Ori的PBI的拷贝数少于带有PUC ORI的PIRE，并且无法提取足够量的质粒进行转染。尽管鱼类基因组中缺乏p16至少是鱼类细胞系抗完全衰老的重要决定因素之一，但尚不清楚是否需要p16引起的完全衰老的RAS激活。