木材分解酵素の大量生産法を切り拓く腐朽菌の菌糸塊形成機構の解明

阐明腐烂真菌菌丝团形成机制，开辟大规模生产木材降解酶的方法

• 批准号: 22K05763
• 负责人: 河内 護之
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05763/
• 关键词: 菌糸塊; 木材分解酵素; ヒラタケ; Pleurotus ostreatus; 担子菌; 酵素生産; 高密度培養; 細胞壁; 腐朽菌

まず、本計画で使用予定であったゲノム編集により作製した菌糸塊分散株について、形質が非常に不安定であったため、相同組換えにより新たな菌株の樹立を行った。その結果、2株の形質が安定した菌糸塊分散株の取得に成功した。また、この菌株からのRNA抽出が完了し、遺伝子発現解析に向けた準備が完了した。また、子嚢菌で菌糸塊分散に関わることが報告されている細胞壁多糖α-グルカンについて、ヒラタケでその生合成遺伝子であるags1を同定した。ヒラタケでags1破壊株を作製し、菌糸塊の分散性について検証を行ったが、菌糸塊は野生株と同様に形成することが明らかとなった。したがって、ヒラタケの菌糸塊形成はα-グルカン以外の細胞壁多糖が関係していることが示唆された。続いて、菌糸塊分散株の細胞壁を経時的に観察する技術を構築する為、細胞壁壁多糖結合ドメインと蛍光タンパク質を融合した細胞壁多糖蛍光プローブ及びキチンに特異的に結合する低分子calcofluor whiteを用いてヒラタケ細胞壁のイメージングを行った。条件を検討することで細胞壁中のグルカンとキチンを同時染色する技術の確立に成功した。また、木材分解酵素の大量生産系を持つジョージアと交渉を進め、共同研究が実行可能な体制を整えた。以上の成果により、次年度に菌糸塊分散の要因を追及する為の基盤技術やサンプルの準備が完了し、加えて菌糸分散株の木材分解酵素生産における実用性を見極める体制の構築も完了した。

首先，基因组编辑产生的菌丝体分散体的特征非常不稳定，并且通过同源重组确定了新的菌株。结果，我们成功地获得了具有稳定特征的两种菌株的菌丝质量分散菌株。此外，从该菌株中提取RNA，并且已经完成了基因表达分析的制剂。此外，在细胞壁多糖α-葡聚糖中鉴定出AGS1，即生物合成基因，据报道，该基因参与了菌丝体中菌丝体的分散体。 AGS1的破坏菌株是用日本垃圾产生的，菌丝质量的分散性得到了验证，但据显示，菌丝体的形成方式与野生菌株相同。因此，有人提出，除α-葡聚糖以外的其他细胞壁多糖参与ROE中菌丝体的形成。接下来，为了构建一种用于观察菌丝体质量分散菌株的细胞壁的技术，基于细胞壁多糖基荧光探针，将细胞壁多糖结合结构域与荧光蛋白融合在一起，以及与小分子的钙氟白色，特异性地与奇特蛋白结合到奇特蛋白，用于对细胞壁成像。通过检查条件，我们成功地建立了一项用于在细胞壁中染色葡萄糖和几丁质的技术。此外，他们一直在与佐治亚州进行谈判，佐治亚州有一个用于降级酶的批量生产系统，并建立了一个允许实施联合研究的系统。通过上述结果，在下一个财政年度已经完成了基本技术和样品来研究引起菌丝质量分散体的因素，并建立了一个系统来确定菌丝质量分散体在木材降解酶产生中的实用性。

项目成果

A NOVEL α-1,3-GLUCAN PROBE CONSISTING OF α-1,3-GLUCAN-BINDING DOMAINS AND A TETRAMERIC RED FLUORESCENT PROTEIN

由 α-1,3-葡聚糖结合域和四聚体红色荧光蛋白组成的新型 α-1,3-葡聚糖探针

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuitsu Otsuka;Hiroyuki Furusawa;Moriyuki Kawauchi;Yoichi Honda;Shigekazu Yano
• 通讯作者: Shigekazu Yano

Agricultural University of Georgia(ジョージア)

佐治亚农业大学

Unique cell wall structure of basidiomycete focused on α-1,3-glucan in Pleurotus ostreatus

平菇中以α-1,3-葡聚糖为中心的担子菌独特的细胞壁结构

• 发表时间: 2023
• 作者: Moriyuki Kawauchi;Yoshinori Nawa;Yuitsu Otsuka;Kenya Tsuji;Yuki Terauchi;Akira Yoshimi;Chihiro Tanaka;Keietsu Abe;Osamu Shirota;Shigekazu Yano;Takehito Nakazawa;Masahiro Sakamoto;Yoichi Honda
• 通讯作者: Yoichi Honda

蛍光イメージングが可視化する担子菌と子嚢菌の細胞壁構造の違い

通过荧光成像观察担子菌和子囊菌细胞壁结构的差异

• 发表时间: 2022
• 作者: 大塚唯;山田夕月;辻健也;河内護之;中沢威人;吉見啓;田中千尋;坂本正弘;矢野成和;本田与一
• 通讯作者: 本田与一

IDENTIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF ALPHA-1,3-GLUCAN SYNTHASE GENE IN PLEUROTUS OSTREATUS

平菇α-1,3-葡聚糖合成酶基因的鉴定及功能分析

• 发表时间: 2022
• 作者: Moriyuki Kawauchi;Yoshinori Nawa;Akira Yoshimi;Chihiro Tanaka;Keietsu Abe;Takehito Nakazawa;Masahiro Sakamoto;Yoichi Honda
• 通讯作者: Yoichi Honda