植物種間で異なる恒常的防衛・誘導的防衛メカニズムの分子進化

植物物种之间不同的稳态和诱导防御机制的分子进化

• 批准号: 22K05645
• 负责人: 杉本 貢一
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05645/
• 关键词: 化学防衛; 植物－植食者相互作用; 二次代謝; Solanum lycopersicum; 野生種; 生物多様性; 食害誘導遺伝子

食害誘導性化合物の精製のためジャスモン酸処理をしたトマト葉を500g収穫し、メタノール抽出物を得た。本抽出物を液液分画により脂溶性夾雑物を除去したのち、ODSカラムによる分画によって粗精製物を得た。粗生成物のLC-MS/MS解析から、候補化合物がジヒドロカフェー酸様構造を持つことが明らかになった。この結果から精密質量から計算した組成式よりもより確からしい構造を推定することができたが、NMRによる構造解析を行うには至らなかったため引き続き原料量を増やして精製を行う必要がある。LC-MS/MSによる部分構造の解析から本化合物をより精度よく推定することができたため、その生合成に関わる遺伝子の探索を行った。2022年12月に類似化合物の生合成酵素遺伝子配列がトマトから単離され、その機能を生化学的に解析したプレプリント論文が一足先に発表されてしまった。当該論文では組換え酵素を用いた生化学的なin vitro解析のみを行っていたため、in vivoでどのような化合物を生合成するのかは明らかになっていない。特に本研究で目的とする推定化合物の材料は酵素反応に使われていなかったため、分からない。そこで当該論文で行われておらず、かつ本研究の目的化合物生合成酵素を明らかにする方法として、ゲノム編集トマトの作出によるin plantaでの遺伝子機能解明を行うこととする。プレプリントで発表された4遺伝子に加え、当該化合物から推測される生合成遺伝子1つを発見し、合計5遺伝子を候補遺伝子とした。各遺伝子のエクソン領域を認識し、かつ他の遺伝子とはお互いに認識しないgDNAを設計し、DNA合成の後にゲノム編集プラスミドにクローニングした。

收集用茉莉酸处理的番茄叶，以净化诱导危害的化合物，收获500 g以获得甲醇提取物。从脂肪级分的脂质液分分馏中除去提取物，然后使用ODS柱分馏获得粗纯化的产物。对粗产物的LC-MS/MS分析表明，候选化合物具有二氢咖啡酸样结构。该结果使我们能够估计一种比根据精确质量计算的组成公式更准确的结构，但是不可能通过NMR进行结构分析，因此有必要继续增加原材料的量并执行纯化。由于可以通过使用LC-MS/MS对亚线结构的分析进行更准确的估算，因此我们搜索了与其生物合成有关的基因。在2022年12月，从西红柿中分离出模拟化合物的生物合成酶基因序列，并首次发表了生化分析其功能的预打印纸。在本文中，进行了使用重组酶的生化体外分析，因此尚不清楚在体内生物合成哪种化合物。特别是，本研究中预定的化合物的材料不用于酶促反应，因此尚不清楚。因此，作为阐明本文未进行的化合物的生物合成酶的一种方法，本研究的目标化合物是通过产生基因组编辑的西红柿来阐明植物学中的基因功能。除了预印本中提出的四个基因外，还发现了从化合物推断出的一个生物合成基因，总共将五个基因用作候选基因。在DNA合成后，设计并将其克隆到基因组编辑的质粒中。

项目成果

Natural defects of trichome formation in a wild tomato accession (Solanum pimpinellifoliu) by C2H2 zinc finger protein gene mutation

C2H2 锌指蛋白基因突变导致野生番茄 (Solanum pimpinellifoliu) 毛状体形成的自然缺陷

• 发表时间: 2023
• 作者: Koichi Sugimoto;Hiroshi Ezura
• 通讯作者: Hiroshi Ezura