マメ科の共通物質coumestrolの生合成と生態機能の解析

豆科常见物质香豆雌酚的生物合成及生态功能分析

• 批准号: 22K05457
• 负责人: 明石 智義
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05457/
• 关键词: マメ科植物; ファイトアレキシン; フラボノイド; イソフラボノイド; 生合成

Coumestrolは多くのマメ科植物が蓄積する「共通物質」であり，イソフラボノイドの一種である.この化合物は細胞内では核に存在し，しかもエストロゲンと構造が類似している．このためcoumestrolは，マメ科植物内でシグナル伝達など重要な役割を果たしている可能性が示唆された. しかしこれまでのところ，生態生理における役割は明らかではない.本研究ではcoumestrolの生合成機構と関与する酵素遺伝子を明らかにし，遺伝子からのアプローチによりマメ科植物におけるcoumestrolの役割を明らかにする．これまでの研究で，isoflav-3-eneからcoumestrolがつくられることをダイズの粗酵素液を用いた酵素アッセイで明らかにしている．しかしisoflav-3-eneは市販されておらず，また不安定な化合物である．このため植物の遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌を用いて簡便で効率的な調製法を確立した．各種阻害剤を用いた植物の粗酵素液と基質を用いた酵素アッセイにより，coumestrol生合成の最後のステップには酸化酵素が関与していることが明らかになった．ダイズ，カンゾウ，ミヤコグサなどのRNA-シーケンス解析を行い，酸化酵素の候補遺伝子を数種選抜した．植物から候補cDNAのクローニングを行った．大腸菌・酵母などで発現させ，組換え酵素タンパク質を用いて機能解析を行うために発現ベクターを作成した．cDNAクロ-ニングができなったものは，人工合成遺伝子を用いて発現ベクターの作成を行った．

香豆酚是许多豆类积累的“常见物质”，是一种异黄酮类型。该化合物在细胞内的核中发现，结构与雌激素相似。因此，已经提出，香菜可能在豆类植物内的信号传导中起重要作用。但是，到目前为止，其在生态生理学中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们将阐明参与香豆菌生物合成机制的酶基因和揭示香豆酚在豆类植物中作用的基因方法。先前的研究表明，可以使用粗大豆酶溶液中的酶测定中的异黄素3-烯产生香豆。但是，异黄素3-烯不能商业上使用，并且是不稳定的化合物。因此，使用结合植物基因的重组大肠杆菌建立了一种简单有效的制备方法。使用粗植物酶溶液和底物使用各种抑制剂的酶测定表明，氧化酶参与了香豆酚生物合成的最后一步。进行了大豆，甘草和百合百合体的RNA测序分析，并选择了几种氧化酶的候选基因。从植物中克隆候选cDNA。使用重组酶蛋白创建了表达载体进行功能分析，这些酶在大肠杆菌，酵母等中表达。对于那些无法cDNA克隆的人，使用人为合成的基因创建表达向量。