酸性条件下で耐熱性を示すGH19型キチナーゼの構造解析と抗真菌酵素製剤の開発

酸性条件下耐热的GH19型几丁质酶的结构分析及抗真菌酶制剂的开发

基本信息

批准号：
22K05423
负责人：
矢野成和
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05423/
关键词：
キチナーゼ耐熱性抗真菌

项目摘要

Lysobacter enzymogenes MK9-1由来のGH19キチナーゼChi19MKは、抗真菌活性を有する酵素であり、Trichoderma reeseiの生育を強力に阻害する。また、pH 1 - 4.5の範囲で優れた熱安定性を示し、pH 4.0の緩衝液中で、5時間、80℃で処理しても活性を保持する。本酵素は、キチン結合ドメインと触媒ドメインから構成されており、本酵素の熱安定性に関わる構造的特徴を調べるために、結合ドメインを欠失させた変異酵素（Chi19MKcat）の作製を行なった。CDスペクトル解析の結果、Chi19MKcatの安定性は若干低下するが、野生型酵素と同様に、加熱することで二次構造の変化がみられ、冷却することで二次構造がもとに戻った。また、加熱処理後のChi19MKcatは、T.reeseiの菌糸の生育阻害活性を維持していた。同様のCDスペクトル解析を細菌に由来する2種類のGH19型酵素について検討したが、加熱後に冷却しても二次構造がもとに戻らなかった。この結果から、Chi19MKの触媒ドメインは、他の細菌由来GH19キチナーゼとは異なり、熱変性後にリフォールディングすることが示唆された。Chi19MKの触媒ドメインが、他のGH19キチナーゼと異なる立体構造を有するのかを調べるために、Chi19MKcatを用いて結晶化を試みた。各種条件をスクリーニングすることで得た単結晶について、X線結晶構造解析を行ったところ、分解能2.7Åで結晶構造が決定した。現在、得られたChi19MKcatの立体構造と既知酵素の立体構造を比較し、異なる構造を有する箇所に変異を導入している。

GH19 几丁质酶 Chi19MK 源自产酶溶杆菌 MK9-1，是一种具有抗真菌活性的酶，可强烈抑制里氏木霉的生长。它还在 1 - 4.5 pH 范围内表现出优异的热稳定性，即使在 pH 4.0 缓冲液中在 80°C 下处理 5 小时也能保持其活性。该酶由几丁质结合域和催化域组成，为了研究与该酶的热稳定性相关的结构特征，我们创建了一种删除了结合域的突变酶（Chi19MKcat）。 CD谱分析的结果是，尽管Chi19MKcat的稳定性略有下降，与野生型酶相似，但在加热时观察到二级结构的变化，并且在冷却时二级结构恢复到其原始状态。此外，热处理后，Chi19MKcat仍保持其抑制里氏木霉菌丝生长的活性。对两种源自细菌的GH19型酶进行了类似的CD谱分析，但即使在加热后冷却后，二级结构也没有恢复到其原始状态。这些结果表明，与其他细菌 GH19 几丁质酶不同，Chi19MK 的催化结构域在热变性后会重新折叠。为了研究 Chi19MK 的催化结构域是否具有与其他 GH19 几丁质酶不同的三维结构，我们尝试使用 Chi19MKcat 进行结晶。对筛选各种条件获得的单晶进行X射线晶体结构分析，以2.7埃的分辨率确定了晶体结构。目前，我们正在将获得的 Chi19MKcat 的 3D 结构与已知酶的 3D 结构进行比较，并在具有不同结构的位置引入突变。