Elucidation of the reaction mechanism of a novel non-heme diiron enzyme, alpha-aminoisobutyrate hydroxylase, and its application

新型非血红素二铁酶α-氨基异丁酸羟化酶反应机制的阐明及其应用

基本信息

批准号：
22K05389
负责人：
日比慎
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

令和４年度は以下の研究項目を実施した。「A. 活性中心の解析」AibH1H2活性中心の分子構造を分析するために、立体構造解析を実施する。この解析のためには、高純度に精製されたAibH1H2タンパク質が必要であり、まずは組換え微生物の大量培養と各種クロマトグラフィーによるタンパク質精製を行った。得られたサンプルはSDS-PAGE上で高純度で精製できていることが確認され、以後の実験に使用するのに十分な品質であった。次いで立体構造を解析するためにクライオEM解析を行った。基質-酵素複合体の解析のために、AibH1H2と基質Aibの混合液を使用した。作成した酵素溶液は、KEKクライオ電顕施設で測定を行った。現在電顕データを解析中であり、構造情報が得られ次第、詳細な構造解析を実施する予定である。「B. タンパク質工学によるAibHYDの機能改変」AibH1H2変異体酵素を作成し、新しい産業用酸化触媒として利用できる酵素分子の開発を目指す。まずはAibHYD活性評価用菌株の最適な反応条件の検討を行った。具体的には、培養温度・誘導剤濃度と添加タイミング・基質濃度と添加タイミング・エネルギー分子の添加などの効果を検討し、最適な反応条件を決定した。次に既知のAibH1H2立体構造を使用したモデリング解析から想定される、基質結合部位を形成するアミノ酸残基を抽出し、変異導入のターゲットとした。変異体酵素を作製する方法として、幾つかの異なる部位特異的変異導入法を試したところ、最も効率よく変異を導入できる手法を決定することができた。また変異体酵素の解析に使用するAibのアナログ化合物に関して、まずは野生型酵素に対する反応性の評価を開始した。各種Aibアナログ化合物とその生成物をキラル分離分析できる分析系の検討も行っており、すでにLC-MS法を用いた分析法を確立している。

以下研究项目是在Oruwa的第四年进行的。 “ A.主动活性分析” AIBH1H2 AIBH1H2实施了立体结构分析，以分析以活动活性为中心的分子结构。为此，需要高纯度纯度AIBH1H2蛋白。已确认所获得的样品是纯度并在SDS-PAGE上纯化的，并且足以用于随后的实验。进行了Cryio EM分析以分析三维结构。为了分析底物 - 酶复合物，使用了AIBH1H2和底物AIB的混合物。在Kek Crylio电动设施中测量了创建的酶溶液。当前，正在分析电子数据，并在获得结构信息后立即实施详细的结构分析。 “ B.” AIBH1H2创建突变酶，并旨在开发可用作新的工业氧化催化剂的酶。首先，我们检查了AIBYD活性评估细菌菌株的最佳反应条件。具体而言，检查了诸如培养温度，衍生浓度，额外的时机，底物浓度，添加额外时间和添加能量分子等效果，并确定了最佳反应条件。接下来，提取了形成底物结合位点的氨基酸残基，该氨基酸残基是通过使用已知的AIBH1H2三维结构的建模分析预期的，这是突变引入的目标。作为产生突变酶的一种方法，确定了几种不同部分的特异性突变引入方法来确定最有效的引入突变。此外，关于用于分析突变酶的AIB的模拟化合物，首先开始反应性与野生酶的反应。我们还在研究可以分析各种AIB模拟化合物及其产品的分析系统，并已经使用LC-MS方法建立了一种分析方法。