Creation of caged peptides possible for dissociation from target and switching target upon photo-irradiation

创建笼状肽，可在光照射下从靶标解离并切换靶标

• 批准号: 22K05348
• 负责人: 渡邉 貴嘉
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05348/
• 关键词: ペプチド; ケージド化合物; 非天然アミノ酸; 進化分子工学; SELEX

本研究では、光照射によって標的分子から解離する「OFF型ケージドペプチド」および光照射によって標的分子から解離したペプチドが別の標的分子に結合するようになる「標的スイッチ型ケージドペプチド」の創製を目指して研究を進めている。令和4年度は、まず複数のケージドアミノ酸誘導体を化学合成し、質量分析によって合成を確認した。次に、アンバーサプレッション法を用いてケージドアミノ酸をペプチドに導入した。実際には、化学的アミノアシル化法でアンバーサプレッサーtRNAにケージドアミノ酸を結合させ、アンバーコドンを持つペプチド発現mRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドアミノ酸導入ペプチドを発現させた。発現させたペプチドの一部に365 nm光照射を行い、光照射前後のペプチドの質量分析を行ったところ、ケージドアミノ酸導入ペプチドの発現および光照射によるケージド基の脱離を確認した。続いて、ケージドアミノ酸を組み込んだペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能か評価した。具体的には、ランダムコドン配列を含むmRNAライブラリを作製し、ピューロマイシンリンカーをハイブリダイズさせた。そして、ケージドアミノ酸-tRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドペプチド-cDNA複合体ライブラリを作製した。その後、モデル実験として抗FLAG抗体に対するケージドペプチドのセレクションを行い、得られたペプチド-cDNA複合体の塩基配列を次世代シーケンサー（NGS）で解析したところ、FLAGペプチドのエピトープ領域にケージドアミノ酸が組み込まれたペプチド配列が有意に濃縮・回収された。このことから、今回構築したペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能であることを実証した。

在这项研究中，我们的目标是创建一种在光照射下与目标分子解离的“OFF型笼状肽”，以及一种在光照射下与目标分子解离的肽结合到“目标开关型笼状肽”。另一个目标分子的研究正在进行中。 2020财年，我们首先化学合成了多种笼状氨基酸衍生物，并使用质谱法确认了合成。接下来，使用琥珀抑制方法将笼状氨基酸引入肽中。事实上，使用化学氨酰化方法将笼状氨基酸连接到琥珀抑制tRNA上，并且通过将笼状氨基酸引入的肽与具有肽表达的mRNA一起添加到无细胞翻译系统中来表达。琥珀密码子。将表达的肽的一部分用365nm光照射，在光照射前后对肽进行质谱分析，证实了笼状氨基酸导入肽的表达以及笼状组由于光照射而脱离。接下来，我们评估是否可以使用包含笼状氨基酸的肽库来选择笼状肽。具体来说，创建了包含随机密码子序列的mRNA文库，并对嘌呤霉素接头进行杂交。然后通过将其与笼状氨基酸-tRNA一起添加到无细胞翻译系统中来创建笼状肽-cDNA复合物文库。随后，我们选择了抗 FLAG 抗体的笼状肽作为模型实验，并使用下一代测序仪 (NGS) 分析了所得肽-cDNA 复合物的碱基序列，显着富集并恢复了肽序列。由此，我们证明了使用这次构建的肽库来选择笼蔽肽是可能的。