Creation of caged peptides possible for dissociation from target and switching target upon photo-irradiation

创建笼状肽，可在光照射下从靶标解离并切换靶标

• 批准号: 22K05348
• 负责人: 渡邉 貴嘉
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05348/
• 关键词: ペプチド; ケージド化合物; 非天然アミノ酸; 進化分子工学; SELEX

本研究では、光照射によって標的分子から解離する「OFF型ケージドペプチド」および光照射によって標的分子から解離したペプチドが別の標的分子に結合するようになる「標的スイッチ型ケージドペプチド」の創製を目指して研究を進めている。令和4年度は、まず複数のケージドアミノ酸誘導体を化学合成し、質量分析によって合成を確認した。次に、アンバーサプレッション法を用いてケージドアミノ酸をペプチドに導入した。実際には、化学的アミノアシル化法でアンバーサプレッサーtRNAにケージドアミノ酸を結合させ、アンバーコドンを持つペプチド発現mRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドアミノ酸導入ペプチドを発現させた。発現させたペプチドの一部に365 nm光照射を行い、光照射前後のペプチドの質量分析を行ったところ、ケージドアミノ酸導入ペプチドの発現および光照射によるケージド基の脱離を確認した。続いて、ケージドアミノ酸を組み込んだペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能か評価した。具体的には、ランダムコドン配列を含むmRNAライブラリを作製し、ピューロマイシンリンカーをハイブリダイズさせた。そして、ケージドアミノ酸-tRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドペプチド-cDNA複合体ライブラリを作製した。その後、モデル実験として抗FLAG抗体に対するケージドペプチドのセレクションを行い、得られたペプチド-cDNA複合体の塩基配列を次世代シーケンサー（NGS）で解析したところ、FLAGペプチドのエピトープ領域にケージドアミノ酸が組み込まれたペプチド配列が有意に濃縮・回収された。このことから、今回構築したペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能であることを実証した。

在这项研究中，我们正在进行研究，目的是创建“非型笼肽”，通过光照射与靶分子分离，并“靶转换型笼蛋白肽”允许通过光照射与另一个靶分子结合的光辐照与靶分子分离的肽。在2022财年，首先将多种笼氨基酸衍生物化学合成，并通过质谱法证实了合成。然后使用琥珀抑制方法将笼氨基酸引入肽中。实际上，使用化学氨基酰基化方法通过结合琥珀抑制剂tRNA来表达笼中的氨基酸，并将其与琥珀色密码子一起表达肽的mRNA，并将其添加到无细胞的翻译系统中。将一部分表达的肽在365 nm的光照射为光，对光照射之前和之后对肽的质量分析证实，引入笼中氨基酸的肽的表达以及通过光照射去除笼子的肽。随后，使用结合笼氨基酸的肽库来评估是否可以选择笼中的肽。具体而言，制备了包含随机密码子序列的mRNA库，并杂交呼毒素。然后，通过将其添加到无细胞翻译系统中，并与笼氨基酸-TRNA一起，制备了笼中的肽-CDNA复合物库。之后，作为模型实验，选择了使用下一代测序仪（NGS）（NGS）分析获得的肽-CDNA复合物的基本序列，并分析获得的肽-CDNA络合物，并将蛋白氨基酸的肽序列纳入了蛋白氨基序列中，将氨基酸纳入了旗帜肽的epepope区域，并恢复了。这表明使用这次构造的肽库可以选择笼肽的选择。