Usefulness of nucleic acid amplification in search for responsible bacteria for sepsis.

核酸扩增在寻找脓毒症致病细菌中的作用。

基本信息

批准号：
22K10622
负责人：
副島美貴子
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

法医解剖事例は、検体採取時のコンタミネーションに加え、腐敗細菌や腸内細菌の増殖などの法医試料に特徴的な要因で、死体試料から特定の細菌が分離、同定されたとしても、それが原因菌であると断定できないという問題があり、敗血症を確実に診断することは難しい。しかし、同定された菌種による感染と解剖・検査所見との間に整合性が確認されるケースもあり、原因菌として矛盾しない微生物の存在の証明は法医診断に有用である。本研究計画では、viability PCR法（生細菌を選択的に増幅するPCR法）を利用した増幅法や核酸抽出法の検討をおこない、法医領域での敗血症原因菌の検索における核酸増幅の有用性を検証する。今年度は、過去の敗血症が疑われた解剖事例に同定された菌種をリスト化し、主要な菌種の純培養菌を購入し、これらを用いて生菌・死菌の分別条件の検討をおこなった。分別には、死菌由来DNAをDNA修飾色素であるEMA (ethidium monoazide)を用いて修飾することでPCR増幅を抑制し生菌由来DNAのみ検出する方法を用いた。EMA処理は、細菌にEMAを含む試薬を添加し浸透させた後、光照射（精度の高い安定したデータ取得が可能な専用装置を本研究費で購入した）するとEMAによりDNAが化学修飾される。純培養菌の生菌と死菌を準備し、EMA処理の時間や回数、EMA濃度を変えて、それぞれの菌種について、最適な死菌抑制効果が得られるEMA処理条件の検討をおこなった。死菌は、熱処理により膜を損傷することで調整し、DNAを抽出、確認は16S rRNA のPCR増幅によりおこなった。

法医解剖病例的特征是在采集样品期间污染，以及法医样品的特征，例如变质细菌和肠道细菌的生长，即使从尸体样品中隔离并鉴定出特定的细菌，也很难确定细菌是否很困难，这是否很难可相互诊断为sepsis sepsis。但是，在某些情况下，证实了与已鉴定的细菌物种与解剖和实验室发现之间的一致性，并且证明存在一致的微生物的证据，因为病原细菌可用于法医诊断。在该研究项目中，我们将使用活力PCR（有选择地放大活细胞的PCR方法）研究放大方法和核酸提取方法，并检查核酸扩增在搜索法医领域中引起脓毒症的细菌时的有用性。今年，我们列出了在以前的解剖病例中鉴定出的物种，这些病例被怀疑是从主要细菌物种中购买的纯培养细菌，并用它们来检查歧视生物和死细菌的条件。为了进行分离，使用一种方法来抑制PCR扩增，通过使用EMA（乙岛乙岛乙酸乙酯）（一种DNA修饰染料）从死细菌中修饰DNA，并仅检测活细菌衍生的DNA。在EMA处理中，在将含有EMA的试剂添加到细菌中后，它被允许穿透，然后将DNA辐射到光中（一种专门的装置，可以在研究基金上购买高精度，稳定的数据采集），DNA被EMA化学修饰。我们准备了纯培养细菌的活细菌和死亡细菌，并改变了EMA治疗和EMA浓度的时间，数量，并检查了每个物种的EMA治疗条件，这些物种提供了抑制死细菌的最佳作用。通过通过热处理损坏膜并提取DNA并通过16S rRNA的PCR扩增进行确认来制备死亡细菌。