口腔常在菌叢のdysbiosisに着目した口腔粘膜疾患の病態の解明

阐明口腔粘膜疾病的病理生理学，重点关注口腔常驻菌群的失调

基本信息

批准号：
22K10316
负责人：
入江浩一郎
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kanagawa Dental College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K10316/
关键词：
口腔粘膜免疫自然リンパ球自然免疫口腔常在菌 3型自然リンパ球

项目摘要

本年度は、口腔粘膜免疫におけるILC3の同定方法の確立を目的とした。まずは、ILC3が最も豊富に存在する小腸で、ILC3の採取方法についてWTマウスを用いて様々な検討を行なった。具体的な方法として、小腸から粘膜固有層を採取した後、digestion（CollagenaseⅡ, DNase）を行い、Percoll濃度勾配法を用いて粘膜固有層リンパ球を採取した。次にflow cytometryでは、ILC3分画関連マーカーの検討を行なった。表面抗原マーカーとしてTCRb, TCRγδ, CD4, B220, Rorγgt, Nkp46, CCR6、またはCD3, CD45, B220, Thy1.2, KLRG1, Nkp46, CCR6の抗体染色でILC3を確認できた。上記の方法で繰り返し検討を行い、最も安定してILC3が採取できる方法を確立した。次に口腔粘膜組織にILC3が存在するのか、上顎粘膜組織及び歯周組織を採取し同様の方法で検討を行なった。その結果、小腸粘膜固有層からのILC3と同様の結果を、上顎粘膜組織から得ることができた。次にILC3の機能的役割を評価するために、口腔粘膜に炎症を誘発させる方法の検討を行なった。炎症を惹起させる歯周病病原菌であるPorphyromonas gingivalis 由来の毒素（LPS）を用いて、WTマウスの歯肉溝に滴下し、免疫応答を経時的（ベースライン、3時間後、1日後、3日後）に免疫染色にて評価した。その結果、ベースライン時と比べて、LPSを塗布してから24時間後にCD4+T細胞・好中球数が有意に増加した (p<0.05)。これらの結果を元に、今後LPS塗布24時間後の歯周組織を採取しILC3の発現を評価していく予定である。

今年，目的是建立一种识别口服粘膜免疫中ILC3的方法。首先，使用WT小鼠进行了各种研究，以在ILC3最丰富的小肠中收集ILC3。作为一种特定方法，从小肠中收集了粘膜中的椎板，然后进行消化（胶原酶II，DNase），并使用Percoll浓度梯度方法收集粘膜淋巴细胞中的lamina propira。接下来，在流式细胞仪中，检查了与ILC3分馏有关的标记。通过TCRB，TCRγδ，CD4，B220，RORγGT，NKP46，CCR6或CD3，CCR6，CCR6，CD45，B220，THY1.2，KLRG1，NKP46和CCR6作为表面抗原标记的抗体染色证实了ILC3。我们使用上述方法进行了重复研究，以建立一种允许最稳定的ILC3收集的方法。接下来，收集上颌粘膜组织和牙周组织，并以与口服粘膜组织中是否存在ILC3相同的方式检查。结果，与小肠粘膜层次的ILC3相似的结果是从上颌粘膜组织中获得的。接下来，为了评估ILC3的功能作用，我们研究了诱导口腔粘膜炎症的方法。牙卟啉单胞菌的毒素（LPS）是一种牙周病原体，是一种诱发炎症的牙周病原体，在WT小鼠的牙龈沟中滴下液，并通过免疫抑制剂评估了免疫反应（基线，3小时，1天，1天3天）随着时间的流逝而评估。结果，与基线相比，在LPS应用后24小时，CD4+ T细胞和中性粒细胞计数显着增加（P <0.05）。基于这些结果，将收集LPS施用后24小时牙周组织，并评估ILC3的表达。