ロングリードシークエンスを用いた混合ゲノム試料解析の探索的研究

使用长读长测序进行混合基因组样本分析的探索性研究

• 批准号: 21K19675
• 负责人: 奥田 貴久
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19675/
• 关键词: ロングリードシークエンサー; ナノポアテクノロジー; 個人識別

第3世代シークエンサー(MinION)の予備試験としてλ-DNAを用いたサンプル調整、ライブラリーの作製、テスト分析を実施した。これにより、MinIONの操作方法や分析法における原理について理解を深めた。血液試料からDNA Mini Kit(キアゲン)を使用してDNA抽出及び定量を行い十分なDNA量が存在していることを確認した。その抽出したDNAからミトコンドリアDNAを選択的に取得するために、エクソヌクレアーゼV処理とエタ沈によりゲノムDNAを除去した。MinIONによるシークエンスの際の参照配列を得るためにミトコンドリアDNA全塩基配列(16kbp)を用いてサンガー法でシークエンスを試みた。今回我々は、ミトコンドリアDNAの全塩基配列をカバーするために、プライマーを21セット、さらに確認のため6セットを追加し、作製した。この結果、本実験の参照配列としての正確なミトコンドリアDNA全配列が得られた。ヒトDNAを用いてロングPCRを実施し、そのPCR産物をMinIONでロングリードのシークエンスを行った。MinIONによるシーケンス後、読み取られた塩基配列を含むfastqファイルの品質チェックは、FastQCを用いて行った。FastQCから得られたレポートにより、シーケンスが正しく行われていることを確認した。次に、fastqファイルのデータはminimap2を用いて参照配列にマッピングを行った。マッピングされたデータは、BAM形式で保存し、必要に応じてクオリティフィルタリングを実行した。その結果、ミトコンドリアDNAの全塩基数が38kbp前後と長く検出されたため、プライマーを２セット再設定したが、いずれも38kbpであったため、再考する必要がある。

使用λ-DNA作为第三代测序仪（小刀）的初步测试进行样品制备，文库制备和测试分析。这加深了我对分析方法中奴才操作方法和原理的理解。使用DNA迷你试剂盒（Qiagen）从血液样品中提取DNA并从血液样品中进行定量，以确认存在足够量的DNA。为了选择性地从提取的DNA中获得线粒体DNA，通过外切核酸酶V处理和ETA沉淀去除基因组DNA。使用整个线粒体DNA序列（16 kbp）尝试使用Sanger来获得尖端测序期间的参考序列。在本文中，我们添加了21组引物，以涵盖线粒体DNA的整个碱基序列，并涵盖了6套以进行确认，并创建了它们。这导致整个线粒体DNA序列作为该实验的参考序列。使用人DNA进行了长PCR，并使用小尖子测序了PCR产物进行长读数。使用奴才进行测序后，使用FASTQC进行了包含读取基序序列的FastQ文件的质量检查。从FASTQC获得的报告证实了该序列的执行正确。接下来，使用minimap2将FASTQ文件中的数据映射到参考数组。映射的数据以BAM格式保存，并在必要时进行质量过滤。结果，长时间检测到线粒体DNA中的总碱数，约为38 kbp，因此重置了两组底漆，但两个引物为38 kbp，因此有必要重新考虑。

项目成果

日本大学医学部社会医学系法医学分野ホームページ

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口腔内液(唾液)中DNAに関する研究(第2報).

口腔液（唾液）中 DNA 的研究（第二次报告）。

• 发表时间: 2021
• 期刊: DNA多型
• 作者: 千葉 正悦;呂 彩子;向井 敏二;早田 詩織;飯酒盃 勇;鉄 堅;磯部 英二;内ヶ崎 西作;奥田 貴久
• 通讯作者: 奥田 貴久

Sudden death of a child associated with invasive non-typeable Haemophilus influenzae infection with underlying IgG2 subclass deficiency

• DOI: 10.1016/j.legalmed.2023.102240
• 发表时间: 2023-03-21
• 期刊: LEGAL MEDICINE
• 影响因子: 1.5
• 作者: Abe，Yuriko;Takano，Chika;Okuda，Takahisa
• 通讯作者: Okuda，Takahisa

A Case Report of Acute Cardiac Tamponade Creation in a Macaque: Echo-Guided Catheter Manipulation to Perforate Coronary Artery

猕猴急性心脏压塞的病例报告：回波引导导管操作以穿孔冠状动脉

• DOI: 10.33160/yam.2023.02.022
• 发表时间: 2023
• 期刊: Yonago Acta Medica
• 影响因子: 1
• 作者: Takanari Hiroki;Okuyama Minami W;Kuroki Kohji;Kondo Hidekazu;Kira Shintaro;Miura Masahiro;Takahashi Naohiko;Okuda Takahisa
• 通讯作者: Okuda Takahisa

口腔内液（唾液）中DNAに関する研究（第４報）

口腔液（唾液）中DNA的研究（第四次报告）

• 发表时间: 2022
• 作者: 千葉正悦;奥田貴久;他
• 通讯作者: 他