iPS細胞とヒト人工染色体ベクターを用いた毛細血管拡張性運動失調症の遺伝子治療

使用 iPS 细胞和人类人工染色体载体治疗共济失调毛细血管扩张症的基因疗法

基本信息

批准号：
22689010
负责人：
香月康宏
金额：
$ 10.57万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

毛細血管拡張性運動失調症(Ataxia-Telangiectasia:AT)はヒト11番染色体上に存在するATM遺伝子の機能欠損により引き起こされる常染色体劣性の疾患であり、小脳失調に伴う神経変性,免疫不全や放射線感受性など多彩な表現型を示す。これまでに巨大な遺伝子を染色体レベルで搭載可能なヒト人工染色体(HAC)ベクターの開発を行い、HACベクターにATM遺伝子全長をクローニングすることで治療用ATM-HACベクターを作製してきた。本研究の目的はAT患者の死亡原因のトップを占める造血系表現型を対象とした、自己iPS細胞による遺伝子治療を行うこと、である。本研究においては、まず、ATM患者由来の培養細胞にレトロウイルスを用いてiPS細胞を誘導するため、まずSlc7a1遺伝子をレトロウイルスによりATM繊維芽細胞に導入した。次に、iPS化に重要とされる4つの転写因子(cMYC,OCT4,SOX2,KLF4)をレトロウイルスにより、上記Slc7a1導入ATM繊維芽細胞に導入した。ATM繊維芽細胞から作製できたiPS細胞(ATM-iPS細胞)をピックアップし、以下の解析を行った。1)各クローンにおいてES様の未分化マーカー(NANOG,OCT4,REX1,SOX2)が発現しているかをRT-PCR法、により確認した。2)3胚葉への分化能があるかを検討するために、SCIDマウスの精巣へATM-iPS細胞を移植し、テラトーマを形成させた。HE染色により分化能を検討したところ、3クローン中、2クローンで3胚葉への分化が確認された。来年度以降は上記ATM-iPS細胞へATM-HACを導入することで、自己iPS細胞による遺伝子治療モデル構築を目指す。

共济失调毛细血管扩张症 (AT) 是一种常染色体隐性遗传疾病，由位于人类 11 号染色体上的 ATM 基因功能缺陷引起，与小脑性共济失调相关的神经变性、免疫缺陷和辐射表现出包括敏感性在内的多种表型。迄今为止，我们已经开发出可以在染色体水平携带大基因的人类人工染色体（HAC）载体，并通过将全长ATM基因克隆到HAC载体中来创建治疗性ATM-HAC载体。本研究的目的是使用针对造血表型的自体 iPS 细胞进行基因治疗，造血表型是 AT 患者死亡的主要原因。在这项研究中，我们首先使用逆转录病毒将 Slc7a1 基因引入 ATM 成纤维细胞中，以在 ATM 患者的培养细胞中诱导 iPS 细胞。接下来，使用逆转录病毒将对于 iPS 转化重要的四种转录因子（cMYC、OCT4、SOX2、KLF4）引入引入 Slc7a1 的 ATM 成纤维细胞中。我们挑选了由ATM成纤维细胞产生的iPS细胞（ATM-iPS细胞）并进行了以下分析。 1)通过RT-PCR确认各克隆中是否表达ES样未分化标记物(NANOG、OCT4、REX1、SOX2)。 2）为了检查它们是否具有分化为三个胚层的能力，将ATM-iPS细胞移植到SCID小鼠的睾丸中并形成畸胎瘤。当通过HE染色检查分化潜力时，在3个克隆中的2个中确认分化为三个胚层。从明年开始，我们的目标是通过将ATM-HAC引入上述ATM-iPS细胞中，构建使用自体iPS细胞的基因治疗模型。